陕西商洛艾叶精油和醇提物成分分析及其抗菌抗氧化活性研究

路 露，姚 琪，束成杰，姜洪芳，朱 凯，石宝俊*

1南京林业大学化学工程学院，南京 210008；2南京野生植物综合利用研究院 南京 211100

艾(学名：ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)是菊科蒿属植物，现收载于2015年版《中国药典》[1]。艾叶既可如《食疗本草》[2]中记录“春月采嫩艾作菜食，或和面作如弹子”当作食物使用，又可如《五十二病方》[3]中所述进行艾熏、艾灸的药用使用。研究表明，艾叶有抗菌抗病毒[4,5]、抗凝血[6]、抗过敏[7]、杀虫[8]等作用。植物挥发油由于具有由于其对人畜无副作用且对环境友好等优点，因此人们往往注重其作为天然杀菌剂、杀虫剂和抗氧化剂的作用[9]。

Nuerbiye等[10]发现了艾叶挥发油对5真菌(疫霉、黑曲霉、粉红聚端孢、青霉、链格孢)的抑菌率为15.2%～74.5%。Wang等[11]发现艾叶水提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和乙型伤寒沙门氏菌均有抑制和杀灭作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最佳。目前很少有人研究艾叶醇提物对枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌和白色念珠菌的抑菌活性。由于传统合成的抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等具有一定的毒副作用，因此无毒安全的天然抗氧化剂受到了重视[12,13]。本文通过GC-MS对艾叶精油成分分析，并比较了艾叶精油和艾叶醇提物对5种常用菌种的抑菌效果，选取了革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阳性菌：大肠杆菌、绿脓杆菌；真菌：白色念珠菌为代表，探索其对不同性质菌种的抑制效果。同时研究了二者的DPPH的清除效果。以期为艾叶的综合开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

艾叶为陕西省商洛洛南县古城镇秦之艾；DPPH、抗坏血酸(Vc)(上海麦克林公司)；氯化钠、葡萄糖、酵母抽提物(国药集团化学试剂有限公司)；琼脂、多聚蛋白胨(日本制药株式会社)。

1.1.2 培养基与菌种

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌由南京野生植物资源综合利用研究院提供。

LB培养基：1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母抽提物、1 g氯化钠、2 g琼脂、100 mL蒸馏水；LB液体培养基去除琼脂即可；YPD培养基：1 g酵母抽提物、2 g蛋白胨、2 g葡萄糖、2.5 g琼脂、100 mL蒸馏水YPD液体培养基去除琼脂即可。以上培养基均进行高压灭菌(121 ℃，20 min)后备用。

1.1.3 仪器

Agilent Technologies 7820A气相色谱-质谱联用仪(安捷伦公司)；MQT-60R震荡培养箱(上海旻泉仪器有限公司)；HCB-1300V垂直层流洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；JW-2017HR高度冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；YP3002电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)。T6紫外/可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 样品制备

1.2.1 艾叶精油制备

参考Nuerbiye等[10]的实验方法，稍加修改。称取200 g艾叶置于圆底烧瓶中，加入3 500 mL水，然后连接挥发油提取器，加热煮沸提取约6 h左右，用指形管接收得到绿色艾叶精油，贴标签保存备用。重复以上实验多次，保存备用。

1.2.2 艾叶醇提物制备

参考Guo等[14]的实验方法，稍加修改。称取30 g艾叶置于1 000 mL圆底烧瓶中，加入300 mL 85%的乙醇，加热约1.5 h。待仪器冷却后用纱布过滤倒出醇提液，旋转蒸发器浓缩，而后用离心机离心15 min，最终得到1 g/mL的艾叶醇提物，贴标签放冰箱保存备用。

1.3 GC-MS成分分析条件

色谱条件为：色谱柱19091J-433-HP-5(30 m × 250 μm，0.25 μm)，初温60 ℃，保留时间为3 min，以1 ℃/min升温至80 ℃，保留0 min，然后以10 ℃/min升温至180 ℃并保留2 min。进样口温度为250 ℃，FID检测器温度为280 ℃；以氦气为载气，流速1 mL/min，样量为1 μL[15]。

质谱条件为：EI离子源200 ℃，四级杆150 ℃；电子能量70 eV；全程扫描。

1.4 抑菌实验

1.4.1 测定抑菌圈

参考先前研究[16，17]的方法，将已灭菌的固体培养基倒入培养皿中，供试菌种均匀的涂布在培养基上，静置10 min。已灭菌的6 mm抑菌圈放置在培养基上，取10 μL样品打在抑菌圈上。静置10 min，DMSO作为对照。放置培养箱中37 ℃培养24 h，测量其抑菌直径，每个样品重复3次。

1.4.2 测定MIC、MBC

参考Wei等[18]的方法，采用双倍稀释法，用DMSO将样品稀释成31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 mg/mL溶液液备用。取5 mL液体培养基、500 μL不同浓度样品和500 μL菌液加入到试管中，充分混匀。试管置于37 ℃，180 rpm摇床培养24 h。以肉眼不见浑浊的最低浓度即为MIC。取50 μL混合菌液于培养皿上，均匀涂布，于37 ℃培养24 h后，无菌体繁殖的最低浓度即为MBC。每个样品重复3次。

1.5 DPPH清除率的测定

DPPH方法是根据氢的提供或自由基清除能力所确定物质的抗氧化活性[19]。参考Khawla等[20]的方法测定艾叶精油和艾叶醇提物对DPPH的清除效果，并进行适当的修改。配制1×10-4mol/L DPPH乙醇溶液和浓度为1、2、4、8、16、32 mg/mL的艾叶精油和艾叶醇提物以及20、40、60、80、100 mg/L的Vc溶液。分别取2 mL不同浓度的样品和2 mL DPPH乙醇溶液。混合均匀，避光反应30 min，在517 nm处测其吸光度。每个样品重复3次。使用下式计算其清除率。

I=[1-(A1-A2)/A0] ×100%

式中，I：清除率；A0：DPPH加乙醇空白组吸光度；A1：样品加DPPH吸光度；A2：样品加乙醇的吸光度。

1.6 统计与分析

本文中所有实验用SPSS 25数据处理软件对实验数据,平行三次。所有数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示。

2 结果

2.1 GC-MS 分析

采用峰面积归一化法得到各组分的相对含量。由图1和表1可知艾叶精油的主要成分为桉叶油醇(21.11%)、萜品烯(7.24%)、龙脑(10.77%)、石竹烯(5.85%)和异香橙烯环氧化物(6.61%)。图2和表2可知艾叶醇提物的主要成分为2-甲基四氢噻吩(20.18%)、异硫氰酸乙酯(10.47%)、二乙二醇二乙酸酯(10.06%)、2-[2-[2-(2-丁氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸乙酯(7.83%)和新癸酸(6.71%)。由此可见二者的主要成分具有很大的差异。

图1 艾叶精油(A)和艾叶醇提物(B)总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) of volatile oil (A) and alcohol extract(B) from A.argyi

表1 艾叶精油的化学组分Table 1 Chemical groups of A.argyi volatile oil

续表1(Continued Tab.1)

表2 艾叶醇提物的化学组分Table 2 Chemical groups of alcohol extract from A.argyi

续表2(Continued Tab.2)

2.2 艾叶精油和艾叶醇提物抑菌效果

不同浓度艾叶精油和艾叶醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌生长抑菌圈直径大小见表3和表4。由表3和表4可知随着艾叶精油和艾叶醇提物浓度的增加，抑菌圈大小成正比的增大。由表3可知艾叶精油对5种菌种菌具有一定的抑制效果，其中对白色念珠菌抑菌作用最佳。由表4可知艾叶醇提取对5种菌种菌具有一定的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌抑菌作用最佳。结果显示艾叶精油和艾叶醇提物的抑菌效果与其浓度呈正相关性，且艾叶精油的抑菌效果更佳。

表3 不同浓度艾叶精油抑菌圈直径Table 3 Diameter of inhibition zone of different concentrations of A.argyi essential oil

不同菌种对不同浓度艾叶精油和艾叶醇提物的敏感度不同(表5)，艾叶精油浓度为1.95 mg/mL时，枯草芽孢杆菌不生长;艾叶精油浓度为3.91 mg/mL时；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不生长；艾叶醇提物浓度为3.91 mg/mL时，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌不生长；艾叶精油浓度为7.81 mg/mL时，白色念珠菌和绿脓杆菌不生长；艾叶醇提物浓度为7.81 mg/mL时，白色念珠菌和金黄色葡萄球菌不生长；艾叶醇提物浓度为15.63 mg/mL时，绿脓杆菌不生长。

表4 不同浓度艾叶醇提物抑菌圈直径Table 4 Diameter of inhibition zone of different concentrations of alcohol extract from Artemisia argyi

表5 最小抑菌浓度结果Table 5 Results of minimum inhibitory concentration

由表6可知，艾叶精油和艾叶醇提物对5种菌种的生长都有不同程度的抑制作用，其中艾叶精油对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制效果较佳，其MIC/MBC值分别为1.95、7.81 mg/mL和3.91、7.81 mg/mL。艾叶醇提物对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用最强，MIC/MBC值分别为3.91、7.81 mg/mL和3.91、15.63 mg/mL。对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和绿脓杆菌的抑菌效果次之。其中艾叶精油和艾叶醇提物对绿脓杆菌的抑菌效果较差。

2.3 艾叶精油和艾叶醇提物对DPPH的清除效果

图2为不同浓度艾叶精油、艾叶醇提物以及Vc对DPPH的清除率变化曲线图。由图2可知艾叶精油、艾叶醇提物对DPPH的清除率随着浓度的增加而增大，具有正相关性。当浓度为32 mg/mL时，艾叶精油、艾叶醇提物对DPPH的清除能力分别达到89.5%和77.6%。其清除DPPH能力分别是100 mg/L Vc的1.46和1.27倍。由此可知艾叶精油和艾叶醇提物均具有良好的抗氧化活性，艾叶精油抗氧化活性强于艾叶醇提物。

3 结论

本研究通过水蒸气蒸馏法从艾叶片中得到艾叶精油，并通过GC-MS分析发现其主要成分为桉叶油醇(21.11%)、萜品烯(7.24%)、龙脑(10.77%)、石竹烯(5.85%)和异香橙烯环氧化物(6.61%)。Wang等[21]通过水蒸气蒸馏法提取的胶东沿海地区艾蒿精油，主要成分为桉油醇(24.54%)、石竹烯(11.57%)、樟脑(9.16%)、刺柏烯(7.87%)、长叶烯(5.30%)；Bao等[22]提取的黑龙江艾叶精油主要成分为4-萜烯醇(18.75%)、6-芹子烯-4-醇(11.74%)、桉油醇(9.10%)、石竹烯氧化物(8.01%)、香芹醇(6.27%)、3，3，6-三甲基-1，4-庚二烯-6-醇(5.21%)。与之相比，桉叶油醇(21.11%)和龙脑(10.77%)含量较高，这可能是由于地区的不同导致的差异性。

表6 艾叶精油和艾叶醇提物对5种菌种的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度Table 6 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of essential oil andalcohol extract of Artemisia argyi against 5 species of bacteria (mg/mL)

图2 艾叶精油、艾叶醇提物(A)和Vc(B)对DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH· radical scavenging ability of essential oil,alcohol extract of Artemisia argyi (A) and Vc (B)

本文通过对比艾叶精油和艾叶醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌的抑菌效果进行比较，均发现艾叶精油的效果优于艾叶醇提物。这可能与挥发油中高含量成分桉叶油醇和龙脑有关，研究表明桉叶油醇和龙脑具有较好的镇痛、抑菌和杀菌作用[19-23]。此外，Zhu等[24]发现美花红千层具有很好的抑菌效果，可能是由于其成分红桉叶油醇(50.67%)、α-蒎烯(19.27%)、2-莰烯(7.85%)含量较高。此外，我们还发现艾叶精油清除DPPH效果也优于艾叶醇提物，当二者浓度为32 mg/mL时，前者的抗氧化能力是后者的1.15倍。Cao等[25]曾发现β-石竹烯增加了SOD含量,降低了MDA水平，提高了其抗氧化活性。由此可知艾叶精油具有良好的抗氧化效果可能归功于其主要成份石竹烯。

综上所述，艾叶精油和艾叶醇提物的抑菌效果与其浓度具有正相关性，抑菌圈、MIC和MBC实验结果显示艾叶精油的抑菌效果优于艾叶醇提物。从对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌5种菌种的抑制效果来看艾叶精油和艾叶醇提物均对枯草芽孢杆菌的抑制效果最佳,其MIC/MBC值分别为1.95、7.81 mg/mL和3.91、7.81 mg/mL。DPPH清除实验结果可知艾叶精油和艾叶醇提物均有良好的抗氧化能力，且前者优于后者。在接下来的研究中需进一步探索主要成分与抗菌活性和抗氧化活性之间存在的关系，为艾叶的开发利用提供可靠的依据。