贵州市售婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的污染情况及特征分析

陈 曦 黄道梅 孟繁博 郑秀艳 李国林

(贵州省农业科学院现代农业发展研究所，贵州 贵阳 550006)

克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)是包含了熟知的阪崎克罗诺杆菌的一个新属，是一种极具污染风险的食源性致病菌，可使新生儿感染坏死性小肠结肠炎、菌血症、脑膜炎等多种疾病，且死亡率极高[1-2]。克罗诺杆菌属分布较为广泛，近些年在五香肉、脱水米粉、调味品、生蔬、即食食品、婴儿食品中均发现克罗诺杆菌的存在，其中婴儿配方乳粉(powdered infant formula，PIF)已经被证实是该致病菌的主要污染源及传播媒介，严重威胁新生儿和婴儿的健康[3-5]。因此，对市售PIF中克罗诺杆菌的污染情况和特征进行分析十分必要。

对分离自市售PIF的克罗诺杆菌进行生化表型分型和基因分型有助于揭示上述来源的克罗诺杆菌的污染情况和种群特征[6]。张丽丽[7]采用生理生化和分子生物学鉴定的方法对市售PIF进行了克罗诺杆菌的分离与鉴定，发现其污染率达到4.55%。Pan等[8]对我国市场中的PIF和较大婴儿的配方乳粉进行克罗诺杆菌污染情况调查，污染率为10.2%，分离得到的49株克罗诺杆菌被分为了11个序列型(sequence type，ST)。此外，有研究者对分离自我国东北和中原地区市售PIF中的克罗诺杆菌进行了分型分析，发现分离自上述来源的克罗诺杆菌主要为阪崎克罗诺杆菌，其中优势的序列型为ST1、ST4和ST64[9]。上述研究在一定程度上揭示了我国克罗诺杆菌的种群特征，但有关贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的污染情况及种群特征的研究尚鲜见报道。

抗生素的使用被认为是治疗克罗诺杆菌感染最常见的方法。研究表明，链霉素、庆大霉素、卡那霉素以及环丙沙星对阪崎克罗诺杆菌均有明显的抗应激作用，上述抗生素被认为是治疗克罗诺杆菌感染的首选[10-11]。但是，长期使用抗生素或使用不当很有可能提高克罗诺杆菌对抗生素的耐受能力，甚至出现多重耐药性菌株[12-13]。Kim等[14]从食品中分离得到的克罗诺杆菌对头孢洛林和氨苄西林具有耐药性。Fei等[9]发现与以往研究相比，分离自中国市售PIF中的克罗诺杆菌对氯霉素和庆大霉素的耐药性有所增加。此外，已有学者从食品样品中分离出了对头孢噻吩、苯唑西林、青霉素、万古霉素具有抗性的克罗诺杆菌，说明目前克罗诺杆菌耐药性有增加的趋势[15-16]。因此，对食品尤其是婴儿食品中克罗诺杆菌的耐药性进行实时监测非常有必要。

本研究以贵州省市售的350份PIF样品为研究对象，采用国标法和16S rRNA基因测序法对其进行克罗诺杆菌的分离鉴定，并通过分离株的生化表型分型、基因分型和抗生素耐药性分析揭示分离自贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的特征，旨在为贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PIF来源：350份PIF样品于2018年1月至2019年1月采集于贵州省各地区超市，其中覆盖了5种品牌的PIF，分别标记为A、B、C、D和E，每种品牌采集70份样品。

主要试剂：克罗诺杆菌标准菌株C.sakazakiiATCC 29544T和EscherichiacoliATCC 25922中国检科院食品安全微生物菌种保藏管理中心；营养琼脂(nutrient agar)、营养肉汤(nutritious broth)、缓冲蛋白胨水(buffer peptone water)、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptone broth- vancomycin)、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soybean agar)、克罗诺杆菌显色培养基(chromogenic medium of cronobacter)，青岛海博生物有限公司；API 20E生化鉴定试剂盒及辅助试剂，法国生物梅里埃公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Master Mix，美国Omega公司；药敏试纸，上海金穗生物科技有限公司；8种抗生素，西宝生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 主要仪器

DNP-250型大容量恒温培养箱，常州菲普实验仪器厂；SJ-CJ-1FD 超净工作台，苏州艾达康医疗科技有限公司；Sartorius Sigma 2-16KL高速冷冻离心机，德国赛多利斯Sartorius集团；伯乐T100梯度PCR仪，济南来宝医疗器械有限公司；Tanon 3500 凝胶图像分析系统，德国耶拿仪器股份公司。

1.3 试验方法

1.3.1 克罗诺杆菌的分离鉴定 以《GB 4789.40-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》[17]的方法为金标准，对PIF样品中的克罗诺杆菌进行分离鉴定；随后再对分离的菌株进行基于16S rRNA的分子鉴定。

1.3.2 API 20E表型分型 参照Nazarowec-white等[18]的报道采用API 20E的方法对克罗诺杆菌进行生化分型，以C.sakazakiiATCC 29544T的表型特征定义为生物表型1，其余分离菌株与其反应模式比较，删除相同的生化反应，保留具有差异的生化反应项目，把每种区别于生物表型1的生化特征定义为另外一种新的生物表型，从而确定克罗诺杆菌的表型分型结果。

1.3.3 多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析 参照Baldwin等[19]的报道，由北京赛百盛基因技术有限公司完成引物(atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA)的合成。以克罗诺杆菌DNA为模板，PCR反应体系(50 μL)：模板DNA 2.0 μL、2× buffer 25 μL、上下游引物各2 μL、ddH2O 19 μL。扩增条件参照Baldwin等[19]的报道。利用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证，并完成基因测序。将测序获得的持家基因序列在克罗诺杆菌MLST数据库(http://pubmlst.org/cronobacter/)中进行比对，获得克罗诺杆菌的等位基因编码，根据对应的等位基因编码最终确定分离菌株的序列型。

1.3.4 分子分型及系统发育树的构建 从GenBank中下载克罗诺菌属及肠杆菌属的相关菌种标准菌株的16S rRNA序列作为参考序列，同测序获得的分离菌株的16S rRNA序列共同进行系统发育分析。之后，将菌株7个持家基因序列串联得到长度为3 036 bp的基因序列进行系统发育分析。利用Mega 6.0软件，选择最大似然算法进行系统发育分析，同时查找并下载克罗诺杆菌属7个种标准菌株所对应的串联序列，将其作为参考菌株序列，构建最小似然系统发育树[20]。

1.3.5 克罗诺杆菌的耐药性分析 选取八类常见的8种抗生素，分别为庆大霉素、磺胺、头孢噻肟、万古霉素、氨苄西林、环丙沙星、四环素、氯霉素，以EscherichiacoliATCC 25922作为质控菌株，利用Kirby-Bauer纸片扩散试验法分析克罗诺杆菌对上述抗生素的耐药性[21]。将菌悬液稀释为0.5(以麦克法兰标准计)，按照药敏纸片的说明书进行试验，根据抗菌药物敏感性试验执行标准(CLSI-M100-S19)[22]对结果进行判读。

2 结果与分析

2.1 克罗诺杆菌的污染情况

以国标的检测结果为金标准，利用16S rRNA基因测序进行基因层面的鉴定，结果如表1所示。鉴定结果均表明22株可疑菌株除S4为阴沟肠杆菌，其余菌株均鉴定为克罗诺杆菌，贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的检出率为6%。此外，16S rRNA基因测序结果显示以99%为阈值，21株克罗诺杆菌中有18株为阪崎克罗诺杆菌，另外3株克罗诺杆菌与阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐克罗诺杆菌的相似性均高达98%以上。进一步分析不同品牌PIF中克罗诺杆菌的污染情况，结果如图1所示，5种不同品牌PIF中，C品牌的污染率最高，为8.57%，A品牌的污染率最低，为4.28%。

表1 API 20E及16S rRNA鉴定结果Table 1 API 20E and 16S rRNA appraisal results

2.2 克罗诺杆菌的表型分型

利用API 20E生化鉴定的菌株共计22株(包括C.sakazakiiATCC 29544T)，菌株S4鉴定结果为阴沟肠杆菌，故不参与表型分型分析。API 20E生化试验结果显示(表2)，分离菌株在利用21项生化反应进行鉴定时，仅对精氨酸、鸟氨酸、脲酶、肌醇、山梨醇5种反应底物以及VP试验的结果呈现差异。按照Nazarowec-white的表型分型方法对克罗诺杆菌进行表型分型，结果表明，22株克罗诺杆菌分为6种生物表型，其中生物表型1所占权重最高(占45.4%)，是分离菌株的主要表型。

图1 不同品牌PIF中克罗诺杆菌的污染率Fig.1 Contamination rates of Cronobacter spp. in different brands of PIF

表2 克罗诺杆菌表型分型结果Table 2 Results of phenotypic typing of Cronobacter spp.

2.3 克罗诺杆菌的分子分型

2.3.1 16S rRNA分型 利用MEGA 6.0软件对菌株的16S rRNA基因序列进行系统发育分析，结果如图2所示，所有菌株分成两个类群，21株分离菌株与克罗诺杆菌标准菌株位于同一类群GroupⅠ，亲缘关系较近，而与菌株S4所在的阴沟肠杆菌GroupⅡ的亲缘关系较远，这与16S rRNA测定鉴定的结果一致。其中21株分离菌株进一步分为3个类群，所在同一类群的菌株系统发育关系较近。

图2 基于16S rRNA 序列的最小似然系统发育树Fig.2 Minimum likelihood phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

2.3.2 MLST分析 利用MLST技术确定菌株的序列型，结果如表3所示，21株克罗诺杆菌分为11个序列型，分别为ST193(7株)、ST157(3株)、ST189(2株)、ST208(2株)、ST37(1株)、ST212(1株)、ST336(1株，丙二酸盐克罗诺杆菌)、ST4(1株)、ST142(1株)、ST17(1株)和ST23(1株)，表明分离自贵州省市售PIF的克罗诺杆菌具有较高的遗传多样性。其中，ST193和ST157的克罗诺杆菌菌株数量分别占总菌株数的33.3%和14.3%，为该地区市售PIF中克罗诺杆菌的优势序列型。

在此基础上对上述菌株进行系统发育分析，结果如图3所示，所有菌株分为两大类群，除菌株S3外，20株分离菌株与阪崎克罗诺杆菌标准菌株同位于Group Ⅰ，同时Group Ⅰ进一步划分为3个簇，归属同一簇中的菌株遗传信息相似，亲缘关系较近。Group Ⅱ包括2个簇，其中菌株S3与C.malonaticusLMG 23826同位于GroupⅡ1，从而进一步将菌株S3归属于丙二酸盐阳性克罗诺杆菌物种。此外，根据系统发育结果可知，分离株的亲缘关系与其来源(不同品牌)无明显内在联系。

2.4 克罗诺杆菌的耐药性分析

由表4可知，21株克罗诺杆菌对四环素和万古霉素耐药性较高，分别为80.1%和90.5%；而对氨苄西林、庆大霉素和氯霉素最为敏感，敏感率均达到95.2%，其次为环丙沙星(76.2%)、头孢噻肟(71.4%)和磺胺(66.7%)。

3 讨论

克罗诺杆菌是PIF中的A类致病菌，严重危害着新生儿的健康，因此，对该致病菌的检测一直是研究重点。O’Brien等[23]调查了欧洲的PIF和婴儿饮品克罗诺杆菌的污染情况，发现PIF中该致病菌的污染率为0，主要的污染存在于以谷物为主的婴儿饮品中。Santos等[24]从42个来自巴西的PIF样品中分离出12株克罗诺杆菌，污染率高达29%。Fatimah等[25]则发现埃及境内PIF中克罗诺杆菌的污染率为5.2%。Fei等[9, 26]于2015年和2018年对我国市售PIF进行了克罗诺杆菌检测，污染率分别为3.5%和2.8%。本研究中，贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的总污染率为6%，对婴幼儿的健康存在潜在的危害，应给予一定的重视。此外，在5种品牌中，C品牌的污染率最高，为8.57%，A品牌的污染率最低，为4.28%。此外，ST193是A、C和D品牌中克罗诺杆菌的优势序列型，在B品牌中未被发现，而ST189是B品牌中克罗诺杆菌的优势序列型。

对PIF中克罗诺杆菌进行生化表型分型和遗传多样性分析有助于了解该种群，以便制定针对性的防控措施[24]。API 20E生化鉴定是基于20种生化反

表3 克罗诺杆菌MLST分析结果Table 3 Results of MLST analysis of Cronobacter spp.

应对克罗诺杆菌进行鉴定和生化分型，这种方法存在一定的假阳性[27]。16S rRNA基因测序可以从基因层面对克罗诺杆菌进行鉴定，并对菌株进行基因分型，但这种方法的辨识度不高，无法将遗传相似性较高的C.sakazakii与C.malonaticus区分开[9]。MLST分析由于其较高的辨识度和可共享性，已被普遍应用于细菌的分子分型。利用上述3种方法对克罗诺杆菌进行分型可以起到互补作用，一种菌株可以同时具有3种型别，组合在一起可进一步区分菌种的多态性。因此，本研究选取上述3种方法对分离株进行生化表型和基因分型，可以得到更全面的数据，从而提高对贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的认识。

本研究中，21株克罗诺杆菌中，20株为阪崎克罗诺杆菌，1株为丙二酸盐克罗诺杆菌，说明分离自贵州省市售PIF的克罗诺杆菌的优势种为阪崎克罗诺杆菌，这与Fei等[9]和Joseph等[20]的报道一致。此外，将21株克罗诺杆菌分为11个序列型，其中ST193和ST157是主要的序列型。不同的是，在欧洲和新西兰等地，ST1、ST40、ST9和 ST3是分离自PIF及其加工环境中克罗诺杆菌的优势序列型[28]。Muller等[29]发现ST83是瑞士PIF及生产环境中克罗诺杆菌的优势序列型。Fei等[9]对分离自我国东北和中原地区市售PIF中的克罗诺杆菌进行了分析，发现ST1、ST4和ST64为优势序列型。上述研究说明，分离自不同地区的克罗诺杆菌的优势序列型不同，这可能与PIF产品产地或销售地的环境有关，因此有必要对特定地区PIF中的克罗诺杆菌进行遗传多样性研究，从而提供有针对性的防控依据。

表4 21株克罗诺杆菌耐药性分析Table 4 Antibiotic susceptibility of 21 Cronobacter strains

图3 7个持家基因串联序列(3 036 bp)的最小似然系统发育树Fig.3 Maximum-likelihood tree of the spliced sequences of the 7 house keeping genes (3 036 bp)

研究表明，早期分离自食品的克罗诺杆菌很少受到外界抗生素的作用，其对大多数的抗生素都非常敏感，因此，抗生素被认为是最有效的治疗人体克罗诺杆菌感染的方法[10]。但是随着抗生素的长时间使用，或者不科学的滥用，受试菌株可能会发生突变或者基因水平转移，导致耐药性增加[27, 30]。已有研究表明，由于临床长期的使用，分离自医院临床环境中的克罗诺杆菌对环丙沙星、氨苄西林、阿卡米星、头孢他啶和亚胺培南呈现不同程度的抗生素耐药性[31-32]。此外，由于克罗诺杆菌有较强的产生生物膜的能力，使得其能够长时间粘附在PIF生产设备表面，并起到减少抗生素对菌体破坏的作用，因此，生物膜对克罗诺杆菌的保护作用为其产生耐药性创造了条件[33]。Fei等[9]研究发现，分离自我国市售PIF中的克罗诺杆菌对四环素和头孢噻肟的耐药性均为0，而在本研究中，分离自贵州省市售PIF中的克罗诺杆菌对四环素和头孢噻肟的耐药性为81.0%和14.3%，说明本研究中的受试菌株对四环素和头孢噻肟的耐受性有所提高。因此，很有必要对PIF中克罗诺杆菌耐药性进行持续的监控。

4 结论

本研究调查了贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的污染情况，发现该地区PIF克罗诺杆菌的总污染率为6%，对婴幼儿的健康具有潜在的威胁。利用API 20E生化鉴定系统、16S rRAN基因测序和MLST分析揭示了分离株的生化分型和基因多样性，共分离得到21株克罗诺杆菌，其中20株为阪崎克罗诺杆菌，1株为丙二酸盐克罗诺杆菌，分为6个生化表型，3个类群和11个序列型，其中ST193和ST157为优势序列型。抗生素耐受性试验表明，分离自贵州省市售PIF中的克罗诺杆菌对四环素和头胞噻肟的耐受性有所提高。本研究结果有助于揭示贵州省市售PIF中克罗诺杆菌的污染情况和种群特征，并为该致病菌的针对性防控和治疗提供了有力的科学依据。