连作植烟土壤具有显著积累特征的两种酚酸的化感效应评价

程亚东 白羽祥 史普酉 杨成翠 贾 孟 杨焕文 王 戈,* 陈 峰

(1 云南农业大学烟草学院，云南 昆明 650201；2 云南省烟草公司，云南 昆明 650201)

酚酸类物质是植物最典型的化感物质之一，多种酚酸类物质在连作土壤中被鉴定，研究发现其中一些酚酸类物质具有明显的积累特征[1-2]。但目前学术界对酚酸类物质是否在连作障碍中扮演重要角色存在较大分歧，争论焦点集中在大多数研究采用远高于酚酸田间实测浓度用于室内化感效应评价，导致得出的毒性阈值远超田间实际浓度[3-4]。因此，基于田间实测值对酚酸类物质的化感自毒效应进行评价可能是解决上述争论的有效途径， 不仅对科学准确地评价酚酸类物质的化感自毒效应具有重要意义，而且可进一步验证酚酸类物质在连作障碍中所扮演的角色。

酚酸类物质可以通过根系分泌、淋溶、根残茬腐解等途径进入土壤，并通过直接或间接方式影响作物的生长发育及产、质量的形成[5]。苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、阿魏酸、间苯三酚等多种酚酸类物质已在连作土壤中被分离鉴定[6-8]，并采用外源纯品物质添加方法，证明其具有生物毒性且存在明显的自毒效应。大量研究表明，酚酸类物质可通过破坏细胞膜结构和功能[9]，干扰植株抗氧化酶系统[10]和光合系统[11]等途径，直接或间接影响作物的生长发育。白羽祥等[12-13]运用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法在连作植烟土壤中鉴定出8种酚酸类物质，其中间苯三酚、阔马酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸和香兰素含量随着连作年限的增加具有显著的积累特征。

烤烟(NicotianatabacumL.)是典型的忌连作作物。近年来研究者围绕连作障碍发生因子及其效应做了大量的探索，初步推测了酚酸类物质在烟草连作障碍中的作用，但多数研究在酚酸类物质的浓度设置上并未考虑田间实测值，其结果的科学性有待商榷[5, 14-15]。因此，本研究拟在前期研究基础上，筛选具有显著积累特征的对羟基苯甲酸和间苯三酚，并参照田间实测值进行梯度处理设置，最大限度反映大田实际情况。本研究基于酚酸田间实测含量并设置不同外源添加梯度，采用基质培养方法，探讨对羟基苯甲酸和间苯三酚对烤烟种子发芽和幼苗生长发育的影响，并对其化感效应进行初步评价，旨在初步明确两种酚酸在烤烟连作障碍中的作用，进一步丰富烤烟连作障碍机理研究，为今后缓解烤烟连作障碍提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017年4—5月在云南农业大学烟草学院植物生理学实验温室(35.41°N，116.41°E)进行，供试材料为烤烟品种K326，裸种和包衣种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。间苯三酚、对羟基苯甲酸标准品购于Sigma公司(美国)。

1.2 试验设计

根据前期研究结果[13]将间苯三酚和对羟基苯甲酸设置3个浓度梯度，分别为间苯三酚：0.20 mg·kg-1(A1)，1.00 mg·kg-1(A2)，5.00 mg·kg-1(A3)；对羟基苯甲酸：0.02 mg·kg-1(B1)，0.10 mg·kg-1(B2)，0.50 mg·kg-1(B3)；以去离子水处理作为对照(CK)。共7个处理。试验分发芽试验和幼苗培养试验。

在培养皿(d=9 cm)中平铺2层相同规格滤纸，加入10 mL不同浓度的酚酸标准液摇匀，随后精选100粒饱满的K326裸种整齐放入培养皿中浸种，每组设置4次重复。24 h后转移至恒温培养箱28℃黑暗培养，试验过程中每天补加5 mL去离子水。播种48 h后开始调查各处理种子发芽数(种子萌发以胚根突破种皮2 mm为标准)，于第7天计算发芽势，第14天计算发芽率。通过发芽势、发芽率、发芽指数及化感效应指数(response index，RI)反映两种酚酸的生物毒性和化感作用[16]。

采用育苗盘(17×8/盘，规格：长66 cm×宽34 cm，孔径30 mm×30 mm×45 mm)育苗，种子表面消毒和催芽后播于育苗盘上，育苗基质由云南省丘北县烟用物资有限责任公司提供。4月1日开始播种，育苗15 d后间苗(4月15日)，间苗后每穴留有1株烟苗，待烟苗长至四叶一心时小心取出长势一致烟苗，移至黑色塑料花盆中采用基质培养法培养，每盆定植1株。每天上午8:00、下午6:00采用环施法向烟苗根系周围浇入10 mL一定浓度相应酚酸处理液，连续浇灌至试验结束。每处理3次重复，共采集3次。于移栽第1、第5、第15天后同一时间采集根系、长势一致同部位烟叶测定各项生理指标。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 根系总长度、表面积、平均直径、根尖数和根系活力测定 每个处理取3棵幼苗，剪取根系用蒸馏水冲洗干净，用Win-RHIZO根系形态分析系统(加拿大Regent Instrument公司)分析根系总长度、表面积、平均直径和根尖数，之后立即采用TTC法测定根系活力[17]。

1.3.2 发芽势、发芽率、发芽指数和化感效应指数测定 根据公式计算发芽势、发芽率、发芽指数和RI：

发芽势=前7 d正常发芽种子数/试验种子数×100%

(1)

发芽率=前14 d正常发芽种子数/试验种子数×100%

(2)

发芽指数=Σ(Gt/Dt)

(3)

RI=(T1/T0-1)×100%

(4)

式(3)中，Gt为t时间内的发芽数，Dt为对应的发芽天数[18-19]。式(4)中，T1表示处理观测值，T0表示对照观测值。RI>0表示处理具有促进作用，RI<0表示处理具有抑制作用。RI绝对值越大化感作用越大[16]。

1.3.3 叶片抗氧化酶活性测定 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的测定按照陈贻竹等[20]的方法，以每分钟抑制氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)光还原50% 为1个酶活力单位(U)，酶活性以 U·g-1FW·min-1表示：过氧化物酶(peroxidase，POD)活性的测定按Omran[21]的方法，以每分钟减少0.01个吸光度值所需的酶量为1个活性单位(U)，酶活性以U·g-1FW·min-1表示；过氧化氢酶(catalase，CAT)活性的测定采用Kar等[22]的方法，以每分钟减少0.01个吸光度值所需的酶量为1个活性单位(U)，酶活性以U·g-1FW·min-1表示；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法[21]，以μmol·g-1FW 表示。

1.3.4 叶绿素含量测定 根据杨振德[23]的方法测定叶绿素a(chlorophyll a，Chl a)、叶绿素b(chlorophyll a，Chl b)和总叶绿素含量。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 17.0统计分析软件对数据进行差异显著性检验(Duncan,s新复极差法，α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 两种酚酸对烤烟种子萌发的影响

由表1可知，随着两种酚酸处理浓度的增加，烤烟种子发芽势、发芽率以及发芽指数不断减小，各处理与CK相比均差异显著(P<0.05),三者对应的化感效应指数均为负值且绝对值不断增大。表明两种酚酸均显著抑制了种子萌发，且随作用浓度增加其抑制作用增强，其中以对羟基苯甲酸的抑制作用更强。

2.2 两种酚酸对烤烟幼苗根系相关指标的影响

由表2可知，间苯三酚抑制了烤烟幼苗总根长、根尖数、根系活力，当浓度为5.00 mg·kg-1(A3)时，以上指标与CK相比均差异显著，其余指标与CK相比均无显著差异。对羟基苯甲酸对烤烟幼苗根系中总根长、根平均直径、根尖数、根系活力的影响均呈现“低促高抑”的浓度效应。总根长、总根表面积、根尖数在浓度为0.10 mg·kg-1(B2)时达到最大值且与CK相比均差异显著；而根平均直径、根系活力在浓度为0.05 mg·kg-1(B1)时达到最大且与CK相比均差异显著。

表1 两种酚酸对烤烟种子萌发的影响Table 1 Effects of two phenolic acids on the germination of flue-cured tobacco seeds

表2 两种酚酸对烤烟幼苗根系总根长、总根表面积、根平均直径、根尖数和根系活力的的影响(处理第15天)Table 2 Effects of two phenolic acids on total root length, total root surface area, root mean diameter, root tip number and root activity of flue-cured tobacco seedlings(treatments on the 15th day)

2.3 间苯三酚对烤烟幼苗叶片抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图1可知，间苯三酚提高了烤烟幼苗叶片的SOD、CAT活性以及MDA含量，降低了POD活性。当浓度为0.20 mg·kg-1(A1)时，POD活性与CK相比差异显著；当浓度为1.00 mg·kg-1(A2)时，SOD、CAT活性以及MDA含量与CK相比均差异显著。除CAT活性外，处理第15天各浓度处理的SOD活性、MDA含量均显著高于CK，POD活性均显著低于CK。可见，间苯三酚通过提高烤烟幼苗的SOD和CAT活性，降低POD活性，从而增强植株对逆境的抗性，对植株起到有效的保护作用。

注：不同小写字母表示同一时间处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level at the same time. The same as following.图1 不同浓度间苯三酚处理对烤烟幼苗叶片SOD、POD和CAT活性及MDA含量的影响Fig.1 Effect of different phloroglucinol treatments on SOD, POD and CAT activities and MDA content in leaves of flue-cured tobacco seedlings

2.4 间苯三酚对烤烟幼苗叶片叶绿素含量的影响

由图2可知，间苯三酚处理较CK均降低了幼苗叶片Chl a、Chl b和总叶绿素含量。不同处理天数对Chl a、Chl b和总叶绿素含量的影响趋势一致，即Chl a、 Chl b和总叶绿素含量随着处理浓度的增加而降低，且处理15 d后A3的Chl a、Chl b和总叶绿素含量均显著低于CK。说明间苯三酚可以降低叶片吸收和利用光能的能力。

图2 不同浓度间苯三酚处理对烤烟幼苗叶片Chl a、Chl b和总叶绿素含量的影响Fig.2 Effect of different concentrations phloroglucinol treatments on the contents of Chl a，Chl b and total chlorophyll content in leaves of flue-cured tobacco

2.5 对羟基苯甲酸对烤烟幼苗叶片抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图3可知，不同浓度对羟基苯甲酸对烤烟幼苗叶片抗氧化酶活性和MDA含量的影响均存在差异。由图3-A可知，随着对羟基苯甲酸处理浓度增加，烤烟幼苗叶片SOD活性呈先升高后降低的趋势，且各浓度处理烤烟幼苗叶片SOD活性均显著高于CK。另外，各浓度处理烤烟幼苗叶片SOD活性随处理时间的延长整体呈增加趋势，处理第15天时，B2的烤烟幼苗叶片SOD活性最高，显著高于相同处理时间的CK及其他浓度处理。由图3-B可知，各处理时间烤烟幼苗叶片POD活性均随着对羟基苯甲酸浓度增加呈降低趋势，其中B3的烤烟幼苗叶片POD活性始终显著低于CK。且高浓度(对羟基苯甲酸浓度为0.10～0.50 mg·kg-1)处理烤烟幼苗叶片POD活性均随着处理时间的延长而增加。由图3-C可知，随着对羟基苯甲酸处理浓度增加，烤烟幼苗叶片CAT活性先升后降，且各添加对基苯甲酸处理均与CK差异显著。各浓度处理烤烟幼苗叶片CAT活性均表现为随着处理时间的延长而增加。由图3-D可知，随着对羟基苯甲酸处理浓度增加，烤烟幼苗叶片MDA含量逐渐增加，不同处理时间对MDA含量的影响趋势一致, 即MDA含量随着处理时间的延长而增加, 且处理15 d各浓度的MDA含量均显著高于CK。综上可知，低浓度对羟基苯甲酸刺激植株抗氧化酶系统产生响应，植株通过提高酶活性来清除活性氧自由基从而抵抗逆境，维持植株正常生长；高浓度对羟基苯甲酸阻碍抗氧化酶的合成，抑制烟苗生长。

2.6 对羟基苯甲酸对烤烟幼苗叶片叶绿素含量的影响

由图4可知，不同浓度对羟基苯甲酸对烤烟幼苗叶片叶绿素含量的影响存在差异，均随对羟基苯甲酸浓度的增加呈先升高后降低的趋势，且各浓度处理的Chl a、 Chl b 和总叶绿素含量与CK相比均差异显著。处理时间对Chl a、Chl b和总叶绿素含量的影响趋势一致，均随着处理时间的延长而降低。表明对羟基苯甲酸对叶片吸收和利用光能的能力存在“低促高抑”的浓度效应。

3 讨论

许多化感物质能显著抑制种子萌发，并影响种子萌发后幼苗的生长发育[24]。不同种类的化感物质对种子萌发表现为促进还是抑制与化感物质种类、浓度以及受体植物种类有较大关系[25-26]。本试验选取连作植烟土壤具有显著积累特征的两种酚酸类物质进行处理，证实间苯三酚和对羟基苯甲酸对烤烟种子的生长均有化感自毒作用，其化感作用均表现为抑制的趋势，且浓度越高，抑制作用越强。这与白丽荣等[27]用紫花苜蓿提取液处理黄顶菊种子的研究结果一致。同时，两种酚酸间比较发现，浓度为0.02 mg·kg-1的对羟基苯甲酸处理下的烤烟种子发芽势、发芽率和发芽指数对应的化感效应指数均低于相同浓度的间苯三酚处理，这说明对于烤烟，对羟基苯甲酸的生物毒性强于间苯三酚。

根系是植物吸收水分和矿质营养的主要器官，其形态和构型很大程度上决定着植物获取养分的能力，在非生物胁迫下，根系最先感受环境刺激并通过改变根系形态和分布以适应环境胁迫[9]。本研究中，随着间苯三酚浓度的升高，烤烟幼苗根系总根长、根尖数和根系活力持续降低。而对羟基苯甲酸对于烤烟幼苗根系总根长、总根表面积、根平均直径、根尖数和根系活力均表现出“低促高抑”的浓度效应，这与王茂胜等[14]用对羟基苯甲酸处理烟苗根系的研究结果一致。已有研究表明，同浓度的对羟基苯甲酸对小麦马铃薯根系生长的抑制作用大于间苯三酚[28-29]，而本研究中浓度为0.50 mg·kg-1的对羟基苯甲酸处理对烤烟幼苗根系生长抑制作用已大于浓度为1.00 mg·kg-1间苯三酚处理。这也进一步说明对羟基苯甲酸对烤烟的生物毒性强于间苯三酚。

酚酸类物质不仅影响植物生长和形态，而且对植株保护性酶和膜透性、渗透物质含量等生理特征也有较大影响[30]。质膜系统作为植物细胞新陈代谢有序进行的中枢系统，高浓度酚酸胁迫致使其过氧化严重，导致MDA含量显著增加，质膜系统和渗透平衡被破坏，直接影响幼苗生长发育[31-34]。秦嗣军等[35]研究发现，低浓度对羟基苯甲酸能提高甜樱桃组培苗根的SOD、POD及CAT活性，但浓度过高则抑制其活性。王艳芳[36]等研究发现，对羟基苯甲酸胁迫较对照显著提高平邑甜茶幼苗叶片的MDA含量，降低抗氧化酶活性。本试验结果表明，不同浓度的间苯三酚处理条件下，烤烟幼苗叶片的SOD、CAT活性均随处理浓度的增加而增加，且处理15 d时，各浓度处理组SOD、CAT活性均高于CK。但POD活性随着处理浓度的增加而减小，推测可能是在外源间苯三酚作用下，烤烟幼苗根系愈伤化减弱，烟苗生长快，较低POD活性更有利于维持细胞活性和组织幼态化，从而降低木质化程度，促进生根。这与姚瑞玲等[37]用间苯三酚处理邓恩桉(EucalyptusdunniiMaiden)组培芽的结果一致。不同浓度的对羟基苯甲酸处理对烤烟幼苗叶片SOD、POD、CAT活性的影响规律均表现为低浓度促进，高浓度抑制，这与谭小兵等[38]用不同浓度根系分泌物处理烤烟幼苗的结果一致。说明植物对不同种类的化感物质响应存在较大差异，在一定酚酸浓度范围内，植株可通过抗氧化酶系统抵御活性氧及氧自由基对细胞膜系统的伤害，增强植物抗逆能力。同时，两种酚酸处理条件下MDA含量均不断增加，且处理15 d时0.50 mg·kg-1浓度处理MDA含量均显著高于CK及其他处理，这也进一步说明随着处理浓度的增加，处理时间的延长，质膜系统受到破坏程度越大。

叶绿体是作物进行光合作用的场所，具有截获光能的作用，叶绿素的含量直接影响光合作用的效率[39]。已有研究表明，包括对羟基苯甲酸在内的多种酚酸可以抑制Chl a和Chl b的合成[40-42]。本试验结果表明，随着间苯三酚浓度的增加，烤烟幼苗叶片Chl a、 Chl b和总叶绿素含量均不断降低；随着对羟基苯甲酸浓度的增加，烤烟幼苗叶片Chl a、Chl b和总叶绿素含量均呈先升高后降低的趋势，这与李鑫等[15]以外源物质作为根系分泌物的单一成分研究对烤烟幼苗的叶绿素含量的影响结果一致。此外，两种高浓度酚酸物质处理时均可显著降低叶绿素含量，说明叶片吸收和利用光能的能力受到抑制，而且作用显著，且随着处理时间的延长，抑制作用越明显。

4 结论

两种酚酸物质均抑制了烤烟种子的萌发。间苯三酚抑制了烤烟幼苗生长发育，对羟基苯甲酸对烤烟幼苗的生长发育的影响规律表现为低浓度促进高浓度抑制。对羟基苯甲酸较间苯三酚具有更强的生物毒性。本研究结果可以丰富植烟土壤连作障碍机理，为今后连作障碍调控提供理论依据。此外，本研究采用基质培养法研究连作植烟土壤中具有显著积累特征的两种酚酸类物质对烤烟K326种子萌发和幼苗生长发育的影响。试验品种单一，而且幼苗的生长受多种因素的调控，这需要在后续研究中着重考虑。