黄连素对人结肠癌细胞株THC-8307奥沙利铂耐药性的影响▲

陈 琳 黄定贵 伍朝春 刘景慧 肖和卫 魏亚楠 李林茂

(广西壮族自治区人民医院体检中心，南宁市 530021，电子邮箱：15007718280@139.com)

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率和死亡率较高，目前已成为全球第四大致命性肿瘤[1-2]，严重危害人体健康。多药耐药是指癌细胞对某种化疗药产生耐药性后，对未接触的、结构及功能不同的多种抗癌药物产生交叉耐药的现象[3]。多药耐药是阻碍癌症化疗实施、影响化疗效果的重要因素[4]。中西医联合治疗可明显改善多种肿瘤的临床缓解率与生存期。黄连素属于异喹啉生物碱，具有抗肿瘤作用，毒副作用低。研究显示，黄连素可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制环氧化酶-2表达[5]，还可调节多重耐药载体P-糖蛋白的表达[6]，这表明黄连素在多药耐药机制中发挥了重要的作用。本研究观察黄连素对耐奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)人结肠癌细胞株耐药性的影响，为结肠癌的治疗提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源：人结肠癌细胞株THC-8307(批号：WG101808)及耐OXA结肠癌细胞株THC-8307/OXA(批号：WG102808)均购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要药物与试剂：细胞培养用胎牛血清(批号：16140071)、高糖杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM;批号：11965-092)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)(批号：15050065)均购自美国Thermo Fisher公司，OXA(批号：61825-94-3)和黄连素(批号：S583634)均购自美国Sigma公司，噻唑蓝试剂盒(批号：M1020)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO；货号：D8371)均购自北京Solarbio公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃、5%CO2条件下进行培养，THC-8307/OXA细胞培养时添加2.5 μg/mL OXA维持其耐药性。

1.2.2 分组及干预方法：取对数生长期的THC-8307和THC-8307/OXA细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2条件下培养24 h后，按分组进行干预。(1)THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞均分为空白对照组、黄连素5 μg/mL组、黄连素10 μg/mL组、黄连素20 μg/mL组进行实验，除空白对照组(不加入任何药物)外，其他组加入相应浓度的黄连素进行干预。每组设置3个复孔，干预培养时间48 h。(2)THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞均分为OXA对照组、黄连素5 μg/mL+OXA组、黄连素10 μg/mL+OXA组、黄连素20 μg/mL+OXA组进行实验，给予相应的药物进行干预，其中使用20 μg/mL OXA进行干预。每组设置3个复孔，干预培养时间48 h。

1.2.3 噻唑蓝比色法测定：干预结束后，吸弃上清，加入90 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，再加入10 μL 噻唑蓝溶液，培养4 h。然后吸弃上清，加入110 μL DMSO溶液，置摇床上低速震荡10 min，使结晶充分溶解，使用FilterMax F3酶标仪(美国MD)于490 nm参数测量各孔吸光值(A值)，结果取均值。按照公式计算细胞存活率及抑制率，细胞存活率=[(给药组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)]×100%，抑制率=(1-细胞存活率)×100%。使用SPSS 25.0软件中Probit模型分析计算半数抑制浓度(median inhibitory concentration,IC50)，其中逆转倍数=OXA组IC50/黄连素+OXA组IC50。每组实验重复5次，结果以(x±s)表示。

1.2.4 细胞形态学的观察：使用日本尼康公司Ti2倒置相差显微镜进行细胞形态学观察，使用电荷耦合装置图像采集系统进行图片采集。

1.3 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 黄连素对THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞存活率的影响 镜下观察发现，添加黄连素对THC-8307和THC-8307/OXA细胞形态和生长状态无影响，细胞均呈上皮样单层排列、梭形、轮廓清晰，见图1。噻唑蓝检测结果显示，无论是THC-8307细胞还是THC-8307/OXA细胞，4组细胞存活率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

图1 不同浓度黄连素对THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞形态的影响(100×)

表1 不同浓度黄连素干预下THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞的存活率(x±s，%)

2.2 黄连素联合OXA干预对THC-8307和THC-8307/OXA细胞存活率的影响 镜下观察发现，与OXA对照组相比，添加黄连素(5、10、20 μg/mL)+OXA对THC-8307细胞形态和生长状态无影响，但可有效抑制THC-8307/OXA细胞生长，可见细胞碎片增多、体积变小、胞质中黑色颗粒增多、贴壁细胞减少等现象(见图2)。THC-8307细胞中，OXA对照组与不同浓度黄连素(5、10、20 μg/mL)+OXA组的细胞存活率比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；THC-8307/OXA细胞中，OXA对照组、黄连素5 μg/mL+OXA组、黄连素10 μg/mL+OXA组、黄连素20 μg/mL+OXA组细胞存活率依次降低(均P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度黄连素+OXA干预下THC-8307和THC-8307/OXA细胞的存活率(x±s，%)

图2 OXA+不同浓度黄连素对THC-8307细胞和THC-8307/OXA细胞形态的影响(100×)

2.3 黄连素干预对THC-8307/OXA细胞耐药性的影响 不同浓度黄连素(5、10、20 μg/mL)+OXA组的IC50均低于OXA对照组，而逆转倍数均高于OXA对照组(P<0.05)，见表3。

表3 4组IC50及逆转倍数的比较(n=5，x±s)

3 讨 论

肿瘤多药耐药增强是造成肿瘤治疗失败的主要原因，也是肿瘤药物化疗的主要障碍。化疗增敏剂是解决多药耐药问题的有效手段之一，其可通过作用于生化代谢的特定环节或分子靶点而影响抗肿瘤药物在细胞内的作用，从而增强抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用或降低其对正常细胞的毒性。多药耐药的肿瘤细胞常常对非同一类型且结构、细胞靶点和作用机理迥然不同的多种抗癌药物同时产生耐受，这使得抗癌治疗陷入困境[7-8]。据美国癌症协会估计，全球每年约49万肿瘤患者死亡，其中90%以上患者在不同程度上受到耐药影响[9]。因此，克服肿瘤细胞的多药耐药，提高抗癌药物疗效，已成为肿瘤治疗亟待解决的关键性问题，寻找相关药物克服肿瘤多药耐药对提高癌症治愈率具有重大意义。

研究表明，多种机制参与肿瘤多药耐药的形成，主要包括：(1)多种转运蛋白，如P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白等过度表达形成药物泵，使抗癌药物在肿瘤细胞内蓄积下降[10-12]；(2)谷胱甘肽-S-转移酶单独或与谷胱甘肽共同参与的细胞毒素代谢及解毒系统诱导的肿瘤细胞保护机制[13]；(3)细胞凋亡相关因子及基因的异常表达[14-15]。近年来，中药提取物的抗肿瘤作用逐渐受到重视。黄连素是从毛茛科黄连根状茎中提取的一种季胺类化合物，其可作为消化道疾病用药。研究表明，黄连素对肝脏肿瘤、结肠肿瘤、肺癌、白血病、食管癌、膀胱癌、脑部肿瘤等均有抑制作用[16-17]，但其机制尚不明确。本研究结果显示，空白对照组不同浓度黄连素(5、10、20 μg/mL)组THC-8307和THC-8307/OXA细胞形态、生长状态及存活率均无明显差异，存活率均在90%以上，这表明浓度为5、10、20 μg/mL黄连素对THC-8307和THC-8307/OXA细胞无明显毒性。在THC-8307细胞中，OXA对照组的细胞存活率低于20%，表明OXA对耐药性低的THC-8307细胞具有明显毒性，可有效抑制其生长。不同浓度黄连素(5、10、20 μg/mL)联合OXA干预下，耐药性低的THC-8307细胞形态、生长状态和细胞存活率与OXA对照组相比无明显差异；然而，在THC-8307/OXA细胞中，OXA对照组、黄连素5 μg/mL+OXA组、黄连素10 μg/mL+OXA组、黄连素20 μg/mL+OXA组的细胞存活率依次降低(P<0.05)。这提示黄连素联合OXA可有效抑制耐药细胞株THC-8307/OXA的生长，且抑制作用具有浓度依赖性；此外，与未加入黄连素的OXA组比较，不同浓度黄连素+OXA组的IC50均降低，而逆转倍数升高，表明黄连素可逆转THC-8307/OXA耐药细胞对OXA的抗性，有效提高THC-8307/OXA耐药细胞对OXA的敏感度，推测黄连素具有化疗药物OXA增敏剂的功效，可提高OXA抗肿瘤活性。

综上所述，黄连素可显著抑制耐OXA的结肠癌细胞株THC-8307/OXA的耐药性，从而提高OXA对细胞生长的抑制作用，提示黄连素可作为化疗药物OXA增敏剂。这为临床应用黄连素作为结肠癌的联合化疗用药提供了理论依据，并为下一步研究黄连素抗人结肠癌细胞耐药性的作用机制奠定基础。