MiR-760通过抑制钙离子信号关键分子干预结肠癌转移的研究*

王晓元 赵轶峰 杨永江 黄 迪 苏卓彬 李 坤 李晶晶 李曙光#

河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科1(075000) 病理科2

背景：微小RNA (miRNA)是一种新的癌症治疗相关的生物学标志物，研究表明miR-760在结直肠癌的发生、发展中起有重要作用。目的：探讨miR-760对结肠癌细胞增殖、周期、迁移和侵袭的调控作用及其机制。方法：采用qRT-PCR法检测结肠癌组织以及结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中miR-760表达。双萤光素酶报告基因实验验证miR-760与STIM1的靶向关系。以蛋白质印迹法、免疫组化染色分别检测结肠癌细胞和组织中STIM1蛋白表达，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞周期，Transwell实验检测细胞迁移、侵袭。构建结肠癌裸鼠移植瘤模型并观察miR-760对肿瘤生长的影响。结果：MiR-760在结肠癌组织和结肠癌细胞中的表达均明显降低，而STIM1在结肠癌组织和细胞中高表达。MiR-760通过与STIM1的3’-UTR互补结合抑制其表达。过表达miR-760能抑制结肠癌细胞增殖，阻滞S期，抑制细胞迁移和侵袭，但上调STIM1能逆转这种抑制效果。在结肠癌裸鼠移植瘤模型中，过表达miR-760能下调STIM1表达并抑制肿瘤生长。结论：MiR-760通过靶向STIM1参与对结肠癌细胞生物学行为的调控，在结肠癌中发挥抑癌的作用。

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大最常见的癌症以及第二大癌症相关死亡原因，据报道，2018年CRC新增病例约180万例，死亡86万例[1]。但目前CRC的发病机制及其生物学标志物仍未完全明确。

基质交互分子1 (stromal interaction molecule 1, STIM1)是一种新发现的Ⅰ跨膜蛋白，主要表达于内质网。作为钙离子的感受器，STIM1可迅速捕获细胞内质网Ca2+水平变化，并将这种信息传递至细胞膜上的SOCs，与Orai1结合，从而启动钙离子依赖性信号通道。STIM1通过调控依赖性钙离子通道参与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等过程。近年研究发现，STIM1在包括结肠癌在内的多种癌症组织中异常表达[2]。

微小RNA(miRNA)是一类由20个左右核苷酸组成的特殊小分子非编码RNA，能与靶基因的mRNA 3’-UTR区域结合，参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程[3]，从而参与肿瘤的发生、发展。已有多项研究证实多种miRNA在结肠癌的发生、发展中起有重要作用，但miR-760在结肠癌中的作用尚不明确。本研究通过观察miR-760和STIM1对结肠癌细胞增殖、S期阻滞、细胞迁移、侵袭等的调控作用，旨在探讨miR-760在结肠癌中的作用及其机制，从而为结肠癌的诊断和治疗提供一定的理论依据。

材料与方法

一、标本来源、细胞株和主要试剂

收集2017年5月—2018年12月河北北方学院附属第一医院96例结肠癌患者手术肿瘤标本及其癌旁正常组织，诊断由病理学检查明确。其中男性56例，女性40例，年龄35～78岁，平均58.6岁。所有患者术前均未接受过化疗，标本取材后冷冻保存。抽取外周静脉血5 mL，抗凝，-80 ℃保存待用。本研究方案通过河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会的批准，患者或患者家属均知情同意。

人正常结直肠黏膜细胞FHC和结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM培养基购自上海碧云天生物技术有限公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；miR-760模拟物(mimics)、阴性对照(miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司；Trizol试剂、逆转录试剂、SYBR Green荧光实时定量PCR试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；STIM1、GAPDH抗体、免疫组化试剂、Ki-67抗体购自Abcam公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学公司；Transwell小室购自美国Corning公司；24只BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，鼠龄4～5周，体质量15～17 g，自由饮水、进食。

二、研究方法

1. 细胞培养和转染：体外培养人正常结直肠黏膜细胞FHC和结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620，置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温箱中培养。取对数生长期的细胞铺于6孔板，稀释浓度约为5×105个/孔，待细胞融合度达60%时，按照转染试剂说明书转染细胞。

2. 双萤光素酶报告基因实验：利用TargetScan (http://www.targetscan.org)预测STIM1的3’-UTR可能存在与miR-760互补结合的位点。将STIM1基因的3’-UTR序列及其突变体插入萤光素酶报告基因，从而构建野生型基因质粒pMIR-STIM1-WT和突变型基因质粒pMIR-STIM1-Mut，然后分别与miR-NC或miR-760 mimics共转染SW620细胞。转染24 h后，检测萤光素酶活性。

3. qRT-PCR法：使用Trizol从细胞株或组织中提取总RNA，反转录成cDNA，按试剂盒说明书行PCR反应。MiR-760引物上游：5’-TGC TTA AGA ATA CGC GTA G-3’，下游：5’-AAC TCC AGC AGG ACC ATG TGA T-3’；内参U6引物上游：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，下游：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’；STIM1引物上游：5’-AGT CAC AGT GAG AAG GCG AC-3’，下游：5’-CAA TTC GGC AAA ACT CTG CTG-3’；内参GAPDH引物上游：5’-AAT GGG CAG CCG TTA GGA AA-3’，下游：5’-GCG CCC AAT ACG ACC AAA TC’-3’。引物均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。PCR反应条件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

4. 蛋白质印迹法：提取各组总蛋白，BCA法定量蛋白浓度。取50 μg蛋白行12% SDS-PAGE电泳，将分离的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入STIM1一抗(1∶500)和内参GAPDH抗体(1∶1 000)。4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤。ECL显影并保存图像。应用Image J软件进行分析。

5. 免疫组化染色：组织切片常规石蜡包埋，梯度乙醇脱蜡、水化，加入3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，修复抗原，封片，室温孵育15 min。滴加STIM1抗体(稀释浓度1∶100)或Ki-67抗体(稀释浓度1∶100)，4 ℃孵育过夜。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释浓度1∶200)。DAB显色，苏木素复染，脱水，封片，采用正置显微镜观察切片。细胞核呈棕黄色颗粒为阳性细胞，计算目的蛋白表达情况。

6. CCK-8实验：将SW620细胞按1×104个/孔接种于96孔板，每孔200 μL，培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育 1～2 h后，应用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值(A值)。

7. 流式细胞术：取对数生长期SW620细胞，应用预冷的PBS溶液重悬细胞，离心，洗涤，加入RNA酶5 μL(10 mg/mL)，加入50 μL PI(1 mg/mL)4 ℃下避光染色30 min，上流式细胞仪检测细胞周期情况。

8. Transwell细胞迁移、侵袭实验：将SW620细胞密度调整为1×106个/mL，接种于Transwell小室的上室(100 μL/孔)。下室(即24孔板底部)加入600 μL含10%胎牛血清的培养基；放入 37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。取出小室，PBS洗涤3次，固定，行0.5%的结晶紫染色，PBS漂洗。应用棉签轻轻拭去小室滤膜上层细胞，显微镜下观察细胞迁移数。

4 ℃下将Matrigel凝胶过夜融化，并以无血清培养基进行稀释。取50 μL Matrigel稀释液滴加到上室，包被滤膜，晾干，置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。其余实验步骤和方法与上述细胞迁移实验相同。

9. 构建结肠癌裸鼠移植瘤模型：将24只裸鼠采用随机数字表法分为miR-NC组(n=12)和miR-760 mimics组(n=12)。将转染后的SW620细胞稀释成约1×1010/mL单细胞悬液，在裸鼠左前上肢腋下处皮下接种0.2 mL的细胞悬液，随后每3 d应用游标卡尺测量肿瘤的最大径(a)和最小径(b)，并计算肿瘤体积(V)，V(mm3)=1/2×a×b2。3周后采用颈椎脱臼法处死裸鼠，分离肿瘤并称重。

三、统计学分析

结 果

一、MiR-760表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性

不同年龄、组织分化程度的结肠癌患者miR-760表达率相比差异无统计学意义，而有无淋巴结转移、不同TNM分期的结肠癌患者miR-760表达率相比差异有统计学意义(P<0.05；表1)。

表1 miR-760表达与结肠癌患者临床病理特征的相关性分析n(%)

二、MiR-760在结肠癌中的作用

qRT-PCR法检测发现，结肠癌组织中miR-760表达显著低于癌旁正常组织(图1A)，结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中miR-760表达显著低于人正常结直肠黏膜细胞FHC(图1B)。因SW620细胞中miR-760表达相对较低，故选取该细胞行后续实验。

SW620细胞转染miR-NC或miR-760 mimics后接种于裸鼠皮下，结果显示miR-760 mimics组肿瘤组织中miR-760表达明显升高(图1C)，而肿瘤体积和重量均明显降低(图1D-1E)。免疫组化染色结果显示，miR-760 mimics组Ki-67表达显著降低(图1F)。上述结果表明miR-760在结肠癌中发挥抑癌的作用。

三、MiR-760对STIM1的靶向调控

TargetScan预测结果显示，STIM1的3’-UTR可能存在与miR-760形成互补结合的位点(图2A)。双萤光素酶报告基因实验结果显示，与pMIR-STIM1-WT+miR-NC组相比，pMIR-STIM1-WT+miR-760组萤光素酶活性明显降低；而共转染miR-760 mimics+pMIR-STIM1-Mut的萤光素酶活性与共转染pMIR-STIM1-Mut+miR-NC相比无明显变化(图2B)。qRT-PCR和蛋白质印迹法结果显示，miR-760 mimics组STIM1 mRNA和蛋白表达明显低于miR-NC组(图2C-2D)。由此可见，miR-760可通过与STIM1的3’-UTR互补结合抑制STIM1表达。

四、STIM1在结肠癌细胞和组织中的表达

qRT-PCR检测结果显示，结肠癌组织中STIM1 mRNA表达明显高于癌旁正常组织(图 3A)。与FHC细胞相比，结肠癌HCT116、HT29、SW480和SW620细胞中STIM1 mRNA表达均明显升高(图3B)。因SW620细胞中STIM1 mRNA表达相对较高，故选取该细胞行后续实验。免疫组化染色和蛋白质印迹法结果显示，结肠癌组织中STIM1蛋白表达明显升高(图3C-3D)。

五、MiR-760和STIM1对结肠癌细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响

CCK-8法结果显示，转染miR-760 mimics细胞的增殖能力明显低于miR-NC组，但共转染miR-760 mimics和STIM1后，细胞增殖能力较单独转染miR-760明显增强(图4A)。流式细胞术发现，转染miR-760 mimics后，S期细胞比例显著低于miR-NC组，但过表达STIM1能逆转miR-760 mimics的调控效果(图4B)。Transwell实验结果显示，转染miR-760 mimics能抑制细胞迁移和侵袭能力，而STIM1能逆转这种抑制效果(图4C)。提示miR-760可能通过抑制STIM1调控结肠癌细胞的生物学行为。

*P<0.05，**P<0.01A：qRT-PCR法检测miR-760在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达；B：qRT-PCR法检测miR-760在结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620以及人正常结直肠黏膜细胞FHC中的表达；C：qRT-PCR法检测裸鼠肿瘤组织中miR-760表达；D：肿瘤体积；E：肿瘤重量；F：免疫组化染色检测Ki-67表达(×400)图1 miR-760在结肠癌细胞和组织中的表达以及在结肠癌裸鼠移植瘤模型中的作用

*P<0.05，**P<0.01A：TargetScan检测显示STIM1的3’-UTR可能存在与miR-760形成互补结合的位点；B：双萤光素酶活性变化；C：STIM1 mRNA表达(qRT-PCR法)；D：STIM1蛋白表达(蛋白质印迹法)图2 miR-760对STIM1的靶向调控

*P<0.05，**P<0.01A：qRT-PCR法检测结肠癌组织和癌旁正常组织中STIM1 mRNA表达；B：qRT-PCR法检测结肠癌细胞中STIM1 mRNA表达；C：免疫组化染色检测STIM1蛋白表达(×400)；D：蛋白质印迹法检测STIM1蛋白表达图3 STIM1在结肠癌细胞和组织中的表达

六、结肠癌裸鼠移植瘤模型中miR-760对STIM1的调控

裸鼠移植瘤模型中，miR-760 mimics组STIM1表达明显低于miR-NC组(图5)。表明miR-760在结肠癌裸鼠移植瘤模型中可负性调控STIM1表达，与体外实验结果一致。

讨 论

MiRNA通过结合靶基因的mRNA 3’-UTR区域，在细胞增殖、分化、凋亡等的发生、发展中发挥重要作用[4]。越来越多的研究表明，miRNA异常表达可引起肿瘤相关基因的激活或失活，通过调控细胞分化、凋亡、增殖促进肿瘤的发生、发展、浸润、转移[3,5-8]。近年多项研究表明，miR-654、miR-376[9]、miR-21[10]和miR-766[11]表达异常与结肠癌密切相关，可通过增强或抑制抑癌基因的表达，促进或抑制结肠癌细胞的转化、生长和转移。有研究[12]表明，miR-760表达下调与结直肠癌患者的不良预后和恶性临床病理特征有关，miR-760可通过调节PI3K/AKT通路和上皮-间质转化(EMT)，明显抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

本研究中，miR-760在结肠癌组织中的表达明显低于癌旁正常组，且结肠癌细胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中的表达亦明显低于人正常结直肠黏膜细胞FHC。提示miR-760表达异常可能与结肠癌的发生相关。MiR-760表达率随淋巴结受累数目、TNM分期的增高而降低，提示miR-760表达与结肠癌患者淋巴结转移和TNM分期相关。

*P<0.05A：细胞增殖能力(CCK-8法)；B：S期细胞比例(流式细胞术)；C：细胞迁移和侵袭能力(Transwell法)图4 miR-760和STIM1对SW620细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响

**P<0.01A：免疫组化染色(×400)；B：蛋白质印迹法图5 结肠癌裸鼠移植瘤模型中miR-760对STIM1表达的调控

萤光素和萤光素酶可极其灵敏、高效地检测基因表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种方法。本研究通过TargetScan预测miR-760在STIM1的3’-UTR具有潜在的结合位点，然后进一步验证miR-760能通过结合STIM1的3’-UTR抑制其mRNA和蛋白表达，表明STIM1是miR-760的靶基因。

STIM1通过调控依赖性钙离子通道参与肿瘤细胞的生物学行为，抑制STIM1表达可促进结肠癌细胞凋亡[13]。本研究中，免疫组化染色和qRT-PCR法检测结果均显示，结肠癌组织中STIM1表达显著高于癌旁正常组织，且多种结肠癌细胞中STIM1表达较FHC细胞明显升高。提示STIM1可能与结肠癌的发展密切相关。体外实验结果显示，转染miR-760 mimics能明显抑制SW620细胞增殖，阻滞S期，抑制细胞迁移和侵袭，但过表达STIM1能逆转这种抑制效应。说明miR-760可能通过负性调控其靶基因STIM1来抑制结肠癌细胞的多种生物学行为。为进一步研究miR-760在结肠癌中的作用，本研究构建了结肠癌裸鼠移植瘤模型。结果显示过表达miR-760能明显下调裸鼠肿瘤组织中STIM1表达，并抑制结肠癌肿瘤生长。表明miR-760具有抑制结肠癌的作用。

综上所述，本研究结果显示结肠癌细胞中miR-760异常表达，miR-760可通过靶向调控STIM1来抑制结肠癌细胞的增殖，阻滞S期，抑制细胞迁移和侵袭，表明miR-760在结肠癌中发挥抑制肿瘤的作用。