克罗恩病患者粪便具核梭杆菌与钙卫蛋白相关性研究*

邢晔陈 胡 彤 徐丽娟 张丽平 叶玉兰 庞 智,2 尹 娟

南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院北区消化内科1(215008) 消化系疾病与营养研究中心2

背景：具核梭杆菌(Fn)是一种常见的肠道细菌，其可能作为条件致病菌参与了炎症性肠病(IBD)的发生。目前尚缺乏IBD患者肠道Fn的定量数据。目的：建立绝对定量real-time PCR方法，检测克罗恩病(CD)患者的粪便Fn，分析其与CD炎症指标的相关性。方法：收集苏州市立医院57例CD患者和41例健康体检者的粪便样本，提取基因组DNA。构建Fn菌株ATCC 25586特异的nusG(transcription antitermination protein)基因至pUC57质粒，作为标准品，以SYBR Green real-time PCR法检测梯度稀释的标准品质粒，建立绝对定量标准曲线。评价该检测方法的敏感性、特异性和稳定性，并以之检测CD患者和健康对照者的粪便Fn丰度，分析Fn丰度与粪便钙卫蛋白(FC)、C反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)的相关性。结果：本研究建立的粪便Fn绝对定量real-time PCR方法敏感性高、特异性强、稳定性好。CD患者粪便Fn检出率和丰度均显著高于健康对照者(P=0.034; P=0.039)，且Fn丰度与FC水平呈显著正相关(r=0.459, P=0.011)。结论：本研究建立的绝对定量real-time PCR方法可用于人粪便样本Fn丰度检测。苏州地区CD患者粪便Fn检出率和丰度显著升高，Fn丰度与炎症活动度指标FC相关。

克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是炎症性肠病(inflam-matory bowel disease, IBD)的两种主要类型，病情反复发作、治愈率低，严重影响患者生活质量。IBD发病机制目前尚未明确。一般认为，在环境因素的影响下，遗传易感宿主肠道对微生物异常的免疫反应与IBD发病相关[1-2]。

人体消化道微生物中约99.9%为细菌，其余为真菌、古菌、病毒等[3]。肠道菌群与IBD发生、发展的关系是当前研究热点。梭杆菌属(Fusobacterium)是一类常见的肠道菌群，其中部分菌种如具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum, Fn)被认为可作为条件致病菌，参与包括IBD在内的胃肠道疾病的发生[4]。研究[5]发现胃肠道疾病患者活检组织中的Fn检出率显著高于健康对照者，且与分离自对照者或CD患者正常黏膜的Fn相比，分离自CD患者炎症黏膜的Fn对肠上皮细胞更具侵袭性。由于最初被认为是一种口腔病原菌，早期对Fn的研究大多集中在其作为牙龈炎和牙周炎的主要病原体方面[4,6]，关于Fn与IBD临床参数相关性的研究较少，且缺乏IBD患者肠道Fn的定量数据。

Fn是一种革兰阴性专性厌氧菌，种内异质性高，目前研究鉴定出的5个亚种分别是animalis、fusiforme、vincentii、polymorphum和nucleatum[4]。对于专性厌氧菌，直接培养法的阳性检出率可因采样、样本运送、接种过程的偏差导致实际检出率低于真实阳性率。基于菌种特异的16S rDNA的real-time PCR检测敏感性更高。本研究旨在建立能快速定量检测IBD患者粪便样本中Fn的real-time PCR方法，为难以通过培养法定量分析的Fn的检测提供经济、可靠的方法；并首次对中国江苏省苏州地区CD患者粪便样本中的Fn进行定量分析，探讨其与CD炎症指标的相关性。

材料与方法

一、标本来源

收集南京医科大学附属苏州医院(三级甲等医院，设有苏州市体检中心)消化内科2018年4月—2019年8月57例CD患者(活动期46例，缓解期11期)的粪便样本，同期41例健康体检者的粪便样本作为对照组。CD诊断符合我国IBD诊治共识，排除急性肠炎和肠易激综合征。所有受检者均无慢性疾病，采样前6个月未服用或注射任何抗菌药物。采样后于无菌环境中将粪便样本按0.2 g/份分装于无菌EP管中，-80 ℃冰箱快速冻存。研究方案经南京医科大学伦理委员会审核批准[南医大伦审(2017)277号]，所有受检者均签署知情同意书。受检者基本信息、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞比例(N%)以及CD患者的CD活动指数(CDAI)、粪便钙卫蛋白(fecal calprotectin, FC)、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)见表1。

表1 CD组和健康对照组临床信息

二、方法

1. 主要试剂和仪器：粪便样本基因组DNA提取试剂盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit, QIAGEN公司)；SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanTaq Plus PCR扩增试剂盒、DNA分子量标准Marker(100～5 000 bp)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；UltraSYBR Mixture(康为世纪)。

Roche LightCycler®480 Real-Time PCR系统(罗氏公司)；Thermo Arktik PCR仪(Thermo Fishier Scientific)；Nano-200超微量核酸分析仪(杭州奥盛仪器有限公司)；核酸电泳仪(Bio-Rad Laboratories, Inc.)；Tanon 5200 Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

2. Fn绝对定量real-time PCR标准品构建：由南京金斯瑞生物科技有限公司合成Fn菌株Fuso-bacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC 25586特异的nusG(transcription antitermination protein)基因，并将之构建至pUC57质粒上(pUC57-nusG)，作为绝对定量real-time PCR检测Fn的标准品。酶切和测序验证合成基因582 bp片段的正确性。

3. Fn 绝对定量real-time PCR敏感性、特异性和稳定性评价：以SYBR Green real-time PCR法检测10倍梯度稀释的标准品质粒(1×10-6～1 ng/μL，对应2.77×102～2.77×108copies/mL)，建立Fn绝对定量标准曲线，确定其最低检测限。根据熔解曲线、PCR产物电泳条带和NCBI Primer-BLAST工具分析结果评价该方法的特异性。以相同浓度标准品不同批次测得Cp值的变异系数(CV)、标准曲线斜率和扩增效率评价该方法的稳定性。

4. 粪便样本基因组DNA提取：参照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit说明书进行操作。称取0.2 g粪便样本至2 mL离心管中，每管加入1 mL InhibitEX溶液，涡旋至粪便样本分散均匀；重悬样本70 ℃温育5 min，涡旋15 s；室温20 000×g离心1 min，取200 μL上清液混合至预加15 μL蛋白酶K的1.5 mL离心管中；加入200 μl AL溶液，涡旋15 s；70 ℃孵育10 min；加入200 μL无水乙醇，涡旋混合；吸取600 μL上述裂解液混合液至QIAamp离心柱，室温20 000×g离心1 min；加入500 μL AW1溶液，室温20 000×g离心1 min，去洗脱液；加入500 μL AW2溶液，室温20 000×g离心3 min，去洗脱液；将离心柱换入新的2 mL收集管，室温20 000×g离心3 min；将离心柱换入新的1.5 mL离心管，加入200 μL去离子水，室温20 000×g离心1 min洗脱DNA。超微量核酸分析仪测定DNA样品浓度和质量。

5. 绝对定量real-time PCR检测粪便样本Fn丰度：在1×10-6～1 ng/μL范围内10倍梯度稀释标准品质粒，对应拷贝数为2.77×102～2.77×108copies/mL，SYBR Green real-time PCR法构建标准曲线。同时检测57例CD患者和41例健康对照者粪便DNA样本中的Fn Cp值。

PCR引物：Fn nusG F 5’-TGG TGT CAT TCT TCC AAA AAT ATC A-3’; Fn nusG R 5’-AGA TCA AGA AGG ACA AGT TGC TGA A-3’。目标片段长度85 bp。

PCR反应体系包括：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，粪便DNA样本1 μL，Fn nusG上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，H2O 9.5 μL，共25 μL。

PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。

根据标准曲线样本Cp值、浓度、拷贝数计算样本Fn丰度。质粒拷贝数计算公式：(质粒浓度) ng/μL×6.02×1023×10-9/(质粒全长bp数×660)，单位copies/mL。粪便样本Fn丰度计算公式：(质粒拷贝数) copies/mL×(洗脱体积) μL×10-3/(粪便质量) g，单位copies/g。

三、统计学分析

结 果

一、标准品构建

将Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC 25586特异的nusG(transcription antitermination pro-tein)基因构建至pUC57质粒后，酶切验证和测序结果正确(图1)。

二、Fn绝对定量real-time PCR敏感性、特异性和稳定性评价

Fn绝对定量real-time PCR熔解曲线和标准曲线见图2。标准曲线示本研究所建立粪便Fn检测方法的检测下限即敏感性为2.77×102copies/mL。熔解曲线峰单一，PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带单一，NCBI Primer-BLAST工具验证显示该方法特异性好。每一稀释梯度的标准品设置2个复孔，3次独立实验重复测定，不同批次间相同浓度标准品Cp值的CV分别为3.6%、3.2%、4.3%、4.2%、3.1%、1.7%和2.6%，均小于5%。3次标准曲线斜率和扩增效率分别为-2.9和2.2、-3.5和1.9、-3.8和1.8。各项指标均提示该方法稳定性好。

图2 Fn绝对定量real-time PCR熔解曲线(A)和标准曲线(B、C)

三、CD患者和健康对照者粪便样本Fn绝对定量real-time PCR检测结果

Fn nusG基因特异的绝对定量real-time PCR检测显示，48例CD患者粪便样本中检出Fn，检出率明显高于健康对照组，差异有统计学意义[84.2%(48/57)对65.9%(27/41), χ2=4.474,P=0.034]。CD患者粪便样本中的Fn丰度亦明显高于健康对照组，差异有统计学意义[两组Fn丰度数据经Y=log10(X copies/g)转化，分别为2.945±0.333和1.846±0.394,P=0.039；图3A]。

A：nusG基因标准品质粒pUC57-nusG构建图谱；B：pUC57-nusG酶切鉴定核酸胶图谱(泳道1：pUC57-nusG质粒；泳道2：EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定pUC57-nusG；M：DNA Marker)图1 Fn绝对定量real-time PCR标准品构建

四、CD患者粪便样本Fn丰度与FC呈正相关

相关性分析表明，CD患者粪便样本中的Fn丰度与FC水平呈显著正相关(r=0.459,P=0.011)，与CRP和ESR均无明显相关性(P>0.05；图3B-3D)。

讨 论

Fn作为一种专性厌氧菌，在常规实验室研究中采用培养法定量难度较高，而16S rRNA测序和定量则存在成本高、检测周期长，以及不同种属细菌的16S rRNA共有保守序列多、不利于特定菌种及其亚种的鉴定等不足。Real-time PCR有绝对定量法和相对定量法两种，后者需要有合适的内参照，常用于细胞、组织等样本的检测，粪便样本则因菌群个体差异大而难以找到合适的内参照。因此，针对待测细菌特异基因的绝对定量real-time PCR方法用于检测粪便样本中某一特定细菌的丰度可信度更高，同时具有成本低、检测周期短的优势，有利于相关常规实验室研究的开展。本研究建立了Fn菌株Fusobacteriumnucleatumsubsp.nucleatumATCC 25586特异的nusG基因质粒标准品，并将其用于CD患者和健康对照者粪便样本中Fn丰度的绝对定量real-time PCR检测，评估显示该方法敏感性、特异性和稳定性均较好，检测下限达到2.77×102copies/mL。

新近对CD患者粪便细菌标记物的研究[7]发现，CD患者粪便中Fn丰度显著增高，伴普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii, Fp)丰度显著降低，粪便Fn与Fp联合检测对于CD具有潜在诊断价值。本研究采用所建立的Fn绝对定量real-time PCR方法对苏州地区CD患者粪便样本中的Fn丰度及其临床意义进行研究，结果显示本组CD患者粪便样本中的Fn检出率和平均丰度均显著高于健康对照者。早年Strauss等[5]的研究就发现分离自CD患者炎症黏膜组织的梭杆菌多为Fn，此种Fn对肠上皮细胞的侵袭力显著高于分离自CD患者正常黏膜或对照者肠黏膜的Fn。Fn可能作为条件致病菌在CD发生、发展中发挥促炎作用。

A：CD组(n=57)与健康对照组(HC, n=41)粪便样本Fn丰度比较；B、C、D：CD组Fn丰度与FC(B)、CRP(C)、ESR(D)相关性分析图3 CD患者粪便样本Fn丰度及其与CD炎症指标的相关性

钙卫蛋白主要来源于中性粒细胞，CD病情处于活动期时，肠黏膜中性粒细胞浸润，可导致FC升高。目前已有相当多关于FC在IBD中诊断价值的研究，国内外大量研究结果表明，FC是一个反映CD患者疾病活动度敏感性较高的指标，并可用于药物疗效和病情监测[8-13]。本研究相关性分析显示，CD患者粪便样本中的Fn丰度与FC水平呈显著正相关，也提示了CD患者粪便Fn丰度与炎症活动度之间的相关性。推测Fn对肠上皮细胞的侵袭力及其诱导的黏蛋白分泌紊乱可能会导致肠道上皮屏障破坏，黏膜通透性增加，促进肠黏膜中性粒细胞浸润，刺激肠上皮细胞、肠黏膜免疫细胞产生白细胞介素-8(IL-8)、IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症介质，诱导和加重肠黏膜慢性炎症[4-5,14-17]。然而，本研究未观察到CD患者粪便Fn丰度与另两个炎症指标CRP和ESR之间存在相关性，需扩大样本量进一步研究。

本研究以苏州地区CD患者为研究对象，关于Fn在UC中的作用和临床意义，国内外已有较多报道。Tahara等[18]采用real-time PCR方法对152例UC患者163份炎症黏膜组织中的Fn和梭杆菌属进行检测，结果显示两者检出率分别为6.3%和53.1%，梭杆菌属所有菌种而非单一的Fn在UC患者中常见，并与结肠慢性炎症持续有关。Ohkusa等[19]的实验研究显示，分离自UC患者结肠黏膜的变形梭杆菌(F.varium)培养上清液可诱导小鼠产生UC样病变，提示F.varium也可能是UC的致病因素之一。

近年房静远教授团队发现结直肠癌化疗后复发患者肿瘤组织中的Fn丰度显著高于未复发患者，并阐明Fn可能系通过调控包括Toll样受体、microRNAs和自噬在内的分子网络参与促进结直肠癌化疗耐药[20]。既往全基因组关联研究[21]也揭示了自噬功能缺陷与CD之间的联系，与CD易感性相关的自噬基因包括ATG16L1、IRGM和NOD2。Thachil等[22]的研究发现CD患者Paneth细胞中自噬异常激活，呈现分泌颗粒数量显著减少等分泌自噬特征。由此推测，CD患者肠道菌群中丰度增加的Fn作为条件致病菌，可能在调控肠黏膜Paneth细胞分泌自噬异常激活中发挥作用。

综上所述，本研究建立的绝对定量real-time PCR方法敏感性高、特异性强、稳定性好，可用于人粪便样本Fn丰度检测。苏州地区CD患者粪便Fn检出率和丰度均显著高于健康对照者，进一步的分析显示Fn丰度与CD炎症活动度指标FC相关，这些发现为后续Fn与CD发病相关机制的研究提供了线索和依据。本课题组后续拟采用此方法开展CD患者粪便Fn丰度的大样本检测，同时建立实验性结肠炎小鼠Fn感染模型，以进一步研究Fn在IBD中的作用机制。