葛根素对骨质疏松大鼠成骨细胞增殖和活性的影响及其作用机制

方志辉 张天锋

(湖北省十堰市国药东风总医院创伤外科，十堰市 442000，电子邮箱：payuv97@163.com)

骨质疏松是一种全身代谢性疾病，近年来我国骨质疏松患者人数逐年增加[1]。骨质疏松的主要特征是骨量减少，骨组织的显微结构出现退行性变化，骨脆性增加[1]。有研究表明，成骨细胞与破骨细胞在骨质疏松的发展中发挥重要作用，在各种类型骨质疏松中都会发生不同程度的成骨细胞凋亡，而成骨细胞可促进骨保护素(osteoprotegerin，OPG)与核因子κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)分泌，起到间接调控破骨细胞信号转导的作用[2]。临床上治疗骨质疏松的药物主要是抑制骨吸收，但是对骨形成作用效果不明显[3]。葛根素通过影响相关蛋白的表达，从而对骨细胞分化起到一定的促进作用[4]。从强直性脊柱炎患者和股骨颈骨折患者髋关节囊组织中分离培养成纤维细胞的研究中，葛根素能抑制正常成纤维细胞和强直性脊柱炎患者成纤维细胞的增殖和成骨性分化[5]。王晓晖等[6]研究发现，葛根素可以有效改善糖尿病骨质疏松患者的临床症状，并且不良反应较少，治疗效果显著。葛根素治疗老年女性骨质疏松症的效果也较为突出，对成骨细胞的增殖也有一定的促进作用[7]，但是关于其作用机制的相关研究较少。本研究探讨葛根素对骨质疏松大鼠成骨细胞增殖和活性的影响及作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取24只无特定病原体级别的3月龄且未经产的SD雌性大鼠，体重(210.5±10.2)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证:SCXK(京)2012-0001。饲养环境室温维持在(25±1)℃，空气相对湿度(52±3)%，通风设置8～12次/h，采用标准饲料进行喂养。本研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 葛根素注射液(山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，国药准字：H20046426)；RANKL抗体(武汉博士德公司提供,批号BAl323)、核因子κB受体活化因子[receptor activator of nuclear factor-κB，RANK；艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：ab219097]、OPG多克隆抗体(Abbkine公司，批号：ABP52083)；磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline-Tween，PBST；苏州亚科科技股份有限公司，批号：H0012)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及大鼠骨质疏松模型的建立：选取6只大鼠作为正常组，其余18只大鼠按随机数字表法分为模型组、低剂量葛根素组和高剂量葛根素组，每组6只。根据文献[8]中的方法制作骨质疏松大鼠模型。使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，约10 min后，待大鼠明显活动减弱、呼吸均匀、触碰四肢无反抗，即可将大鼠背部朝上四肢固定。剔除背部毛发，用碘附常规消毒腰背部，再用酒精棉球脱碘附，在肋脊角水平位置，沿与正中腰部平行且距离正中线约2 mm处，左右对称分别做一小切口(约3 mm)。切开肌肉进入后腹膜并且沿子宫分支找出卵巢，在输卵管处结扎卵巢动静脉切除卵巢，行背式卵巢去势。依次缝合肌层及皮层，碘附消毒，待大鼠完全清醒后，放回鼠笼，观察建模情况。大鼠运动量明显减少，在等同外力下模型大鼠出现乏力，抽筋、骨折，则视为建模成功。其中建模成功15只，模型组、低剂量葛根素组及高剂量葛根素组各5只。

1.3.2 干预方法：建模成功后，低葛根素组、高剂量葛根素组分别给予50 mg/kg和75 mg/kg葛根素注射液皮下注射干预，正常组、模型组大鼠给予等体积的生理盐水皮下注射干预。4组大鼠干预均1 d/次，连续干预3周。在干预过程中均正常饲养，自由饮水。

1.3.3 成骨细胞培养：干预3周后，采用断头法处死大鼠，放置于75%的酒精中浸泡10 min后在无菌条件下揭去头皮，取颅盖骨，清除表面结缔组织，之后使用生理盐水冲洗至发白，剪碎后使用5 mL 0.25%胰蛋白酶消化20 min；弃去消化液，骨片移至0.1%Ⅰ型胶原酶的消化液中消化60 min，然后弃去消化液，再次将骨片移至0.1%Ⅰ型胶原酶的消化液中消化60 min；将过滤后的消化液2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，将沉淀的细胞加入至5 mL杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培养液中，接种于培养皿中，在37℃、含5%二氧化碳、湿度为95%的培养箱中培养1 d后DMEM换液一次，将不贴壁的细胞清除，之后2～3 d换液一次，纯化成骨细胞，培养至第3代待用。

1.3.4 四甲基偶氮唑盐法检测成骨细胞的增殖：将纯化第3代的成骨细胞再传1代后，使用0.25%胰蛋白酶以及0.02%乙二胺四乙酸消化计数，按2×103个/孔的密度接种在96孔板内，加入含10%小牛血清的5 mL DMEM培养基，在37℃、5%二氧化碳环境下进行培养，24 h后当细胞贴壁稳定后，采用平衡盐溶液清洗，使用四甲基偶氮唑盐法检测成骨细胞增殖，试剂购自上海邦景实业有限公司(批号：BJ-0251BT)，使用酶标仪(南京贝登医疗股份有限公司，型号MR-96A)在490 nm波长处读取A值，分析成骨细胞增殖指数。

1.3.5 对硝基苯磷酸盐法检测成骨细胞中ALP的活性：细胞培养同1.2.2。使用对硝基苯磷酸盐法分析成骨细胞中ALP的活性，试剂购自上海研谨生物科技有限公司(批号：S46070-1g)使用酶标仪在405 nm波长处读取A值，分析成骨细胞ALP活性。

1.3.6 病理学观察：每组大鼠处死后快速截取大鼠股骨骨组织，将其置于4%的多聚甲醛中进行固定，制作常规石蜡切片，在浓度0.5%苏木精-伊红染色液中染色10 min，自来水冲洗1次；使用乙醇梯度进行脱水处理，最后用中性树胶进行封片。

1.3.7 骨代谢相关指标检测：处死大鼠前抽取大鼠腹部静脉血3 mL，以3 000 r/min离心10 min后，分离上层血清，用于骨代谢相关指标的检测。(1)骨钙素水平。采用5 mmol/L碳酸盐包被缓冲液将抗原进行溶解，浓度为10～20 μg/mL，加入96孔酶标板中，100 μL/孔，4℃过夜保存。第2天舍弃包被液，采用PBST洗涤3次，每孔中加入1%的150 μL牛血清蛋白(上海联迈生物工程有限公司，货号：LM-161)，在37℃环境中封闭1 h。之后采用PBST洗涤3次，在每孔中加入100 μL不同倍比稀释度的牛血清，加入骨钙素标准品(上海江莱生物科技有限公司，批号：JL2019-48T)，37℃孵育2 h。采用PBST洗涤5次，加入100 μL稀释后的辣根过氧化物酶(上海源叶生物科技有限公司，货号：9003-99-0)标记的二抗(1 ∶5 000；远慕生物科技有限公司，批号：YM-XQ0470P)，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，使用显色剂显色20 min，在酶标仪上读取405 nm波长处的A值，测定骨钙素水平。(2)钙水平：严格按照偶氮胂Ⅲ试剂盒及其相关试剂[由北京森美希克玛生物科技有限公司提供，京药监械(准)字2010第2400914号]说明书进行操作。(3)磷水平：将2 mL静脉血放入50 mL消化管中，加入混合酸15 mL，过夜。次日，将消化管放入消化炉中，消化开始时可将温度调低约130℃左右，然后逐步将温度调高至240℃左右进行消化，直至可见白烟、液体变成无色或黄绿色。取样品及空白液各2 mL加入20 mL具塞试管中，然后依次加入2 mL钼酸铵溶液、lmL亚硫酸钠溶液、1 mL对苯二酚溶液，加蒸馏水定容至20 mL，混匀，静置30 min，在波长660 nm处测定其A值，并根据测出的A值在标准曲线上算得磷含量。(4)骨密度：采用双能X线骨密度测量仪检测大鼠股骨骨密度。

1.3.8 免疫印迹试验检测RANKL、RANK、OPG蛋白表达水平：干预3周后，将提取到的大鼠成骨细胞标本，研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规蛋白提取，采用二喹啉甲酸法进行总蛋白定量分析，试剂购自北京谱析科技有限公司(批号：B4509)。50 μg的蛋白样品上样后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过蛋白电转到聚偏二氟乙烯膜，使用5%的脱脂奶粉TBST缓冲液(苏州亚科科技股份有限公司，批号：H0013)进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液(RANKL、RANK、OPG按照1 ∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中过夜保存；第2天使用TBST缓冲液洗涤后加入二抗稀释溶液(按照1 ∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次使用TBST缓冲液洗涤，加入电化学发光液(Biochannel公司，批号：BC-WB-004-100ml)，曝光2～3次，取平均值。使用Image Lab软件分析蛋白条带灰度值，并计算蛋白质相对分子质量。内参蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH；抗体购自上海诗溪化工科技有限公司，批号JK40085)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠成骨细胞增殖指数和ALP活性比较 高剂量葛根素组、低剂量葛根素组、正常组、模型组成骨细胞增殖指数及ALP活性均依次降低(均P<0.05)。见表1及图1。

表1 4组大鼠成骨细胞增殖指数和ALP活性比较(x±s)

图1 4组大鼠成骨细胞增殖指数(二甲基亚砜染色，×50)

2.2 4组大鼠股骨组织病理学变化 正常组大鼠骨组织细胞分布规则有序，细胞之间的间距小；模型组大鼠骨组织髓腔之间的间隙较大，细胞分布不规则且疏松；葛根素组大鼠骨组织细胞间隙减小，髓腔之间的间隙也逐渐缩小，其中高剂量葛根素组大鼠表现更加明显。见图2。

图2 4组大鼠股骨组织病理组织学变化(苏木精-伊红染色，×400)

2.3 4组大鼠骨代谢相关指标比较 模型组、低剂量葛根素组、高剂量葛根素组、正常组骨密度以及血清骨钙素水平均依次降低，模型组、低剂量葛根素组、正常组、高剂量葛根素组血清钙和磷水平依次降低(均P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠骨代谢相关指标比较(x±s)

2.4 4组大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相对表达量比较 模型组、低剂量葛根素组、高剂量葛根素组、正常组RANKL、RANK蛋白相对表达量依次降低，而OPG蛋白相对表达量依次升高(均P<0.05)。见表3、图3。

表3 4组大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白相对表达量比较(x±s)

图3 4组大鼠RANKL、RANK、OPG蛋白电泳图

3 讨 论

在骨代谢中，破骨细胞促进骨吸收，成骨细胞促进骨形成，当骨吸收和骨形成相对平衡时，才能维持机体正常骨量[9]。随着年龄的增加，胰岛功能逐渐降低，患骨质疏松症的危险性逐渐增高[1]。骨质疏松有较高的致残性，严重影响人们的生活质量。葛根素具有和雌激素相似的化学结构，可以起到雌激素的作用，预防绝经后骨质疏松的效果显著，且毒副作用较小[10]。本研究中，病理组织学结果显示，模型组大鼠骨组织髓腔之间的间隙较大，骨组织细胞分布不规则、疏松，说明建模成功。ALP作为骨形成过程的主要参与酶之一，可反映成骨细胞的分化、成熟及活性，ALP活性随着成骨细胞分化而逐渐增强，同时也反映了成骨细胞的活性[11-12]。同时，ALP是骨基质形成的重要标志物，可以反映骨形成，评估骨转化的情况[13]。此外，陈明等[14]研究发现，ALP通过分解磷酸酯中的无机磷，进一步促进基质发生矿化。本研究结果显示，低剂量及高剂量葛根素组大鼠成骨细胞的增殖指数和ALP均高于模型组及正常组(均P<0.05)，说明葛根素能够提高成骨细胞活性；而且高剂量葛根素组大鼠成骨细胞的增殖指数和ALP均高于低剂量葛根素组(均P<0.05)，说明高剂量(75 mg/kg)的葛根素可更显著地增加ALP活性，对成骨细胞增殖的促进作用更明显。研究表明，骨代谢标志物水平增高时，提示高骨转换以及骨丢失加快[15]。血清钙、磷水平是骨代谢主要的骨矿成分，两者的含量稳定是骨吸收和骨形成平衡的重要标志[16]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中骨密度、骨钙素、钙、磷水平均高于其他3组(均P<0.05)，说明骨质疏松会导致骨转换和骨丢失加快；而模型组、低剂量葛根素组、高剂量葛根素组骨密度、骨钙素、钙、磷水平依次降低(均P<0.05)，说明葛根素能够降低大鼠骨密度以及血清骨钙素、钙、磷含量，维持骨吸收和骨形成的平衡，且高剂量(75 mg/kg)的葛根素作用更为显著。

RANKL/RANK/OPG相关通路是骨吸收和骨形成过程中重要的调节通路，其中OPG蛋白是唯一与成骨细胞膜上RANKL相结合的受体，主要作用是在RANKL和RANK结合的过程中起到抑制作用，从而阻断破骨细胞前体发生分化和融合，对成熟的破骨细胞有明显的抑制作用，从而对破骨细胞的凋亡起到一定的抑制作用[16-17]。研究表明，成骨细胞受到骨吸收的刺激后会促进RANKL分泌，而RANKL可以与破骨前体细胞表面的RANK结合，激活核因子κB通路，从而促进成熟的破骨细胞分化形成[18-19]。成骨细胞经过成骨相关因子的刺激，会促进OPG分泌，与RANKL竞争与RANK受体结合，对破骨细胞的形成以及活性起到一定的抑制作用[20]。本研究结果显示，模型组、低剂量、高剂量葛根素组大鼠的RANKL、RANK相对表达量依次降低，而OPG相对表达量依次升高(均P<0.05)，提示葛根素可能通过调控RANKL/RANK/OPG相关通路，从而发挥对骨质疏松大鼠成骨细胞活性的促进作用。

综上所述，葛根素可以促进骨质疏松大鼠成骨细胞增殖，提高成骨细胞活性，维持骨吸收和骨形成的平衡，其机制可能与调控RANKL/RANK/OPG相关通路蛋白的表达有关。