miR-144-3p及MAPK1 mRNA在慢性粒细胞白血病急变期单个核细胞内的表达

康娅，杨晓雨，王梦昌

西安交通大学第一附属医院血液内科1、医疗信息管理办公室2，陕西 西安 710061

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，C ML)是血液系统恶性肿瘤[1]，目前尚不能根治。大部分CML 经历慢性期、加速期至急变期，最终进入疾病终末状态。现有的研究表明白血病干细胞是白血病发生的根源。寻找到靶向清除白血病干细胞的有效方法可治愈白血病[2]。微小RNA (miRNA)在转录后水平调控基因表达为白血病干细胞的研究提供了新的方向。本课题组初期运用微小RNA基因芯片，检测2例服用二代酪氨酸激酶抑制剂尼洛替尼的CML (慢性期、加速期各1 例)患者治疗前后外周血miRNA 表达谱，发现miR-144 治疗前后存在明显异常表达，治疗后上调。这提示miR-144 可能与CML 治疗药物或发病机制有关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路参与到CML发病的信号通路中，其中MAPK1 可调节细胞的各个阶段[3]，与肿瘤的生长扩散密切相关。查询Targetscan7.1数据库系统，miR-144家族中的miR-144-3p是一个典型的癌症抑制因子，参与多种癌症细胞的增殖调控[4]。miR-144-3p 可与1 043 个mRNA 的3'非翻译区结合，包括与白血病发病有关的MAPK等基因，推测在慢性粒细胞白血病急变期miR-144-3p与MAPK基因之间可能存在某种联系。具体机制不清。本研究利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR方法)，对慢性粒细胞白血病急变期患者和正常健康者的外周血单个核细胞进行miRNA-144-3p和MAPK1 mRNA定量检测，比较两组受检者是否存在差异表达，以期能为慢性粒细胞白血病干细胞研究提供新的思路。现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验所需要的C ML急变期外周血均来自于2018 年11 月至2019 年3 月就诊于西安交通大学第一附属医院血液内科的患者(病例组)，共10 例，男性3 例，女性7 例，中位年龄41.00 [30.50～51.25]岁；慢性粒细胞白血病急粒变5 例，慢性粒细胞白血病急淋变5 例。CML 急变期诊断符合《中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016 年版)》[1]。正常对照组外周血样本均来自西安交通大学第一附属医院血液内科工作人员，共11 例。所有标本获取及处理流程按照西安交通大学第一附属医院伦理委员会所制定的伦理学标准，并获得伦理批件，实验获得受试对象或其家庭成员的同意，并签署相关同意书。

1.2 实验主要试剂及来源 Trizol (美国，Ambion公司)；HiScript逆转录酶、5×HiScript缓冲液、50×ROX Reference Dye 2、SYBR 绿色标记材料(美国，VAZYME公司)；核糖核酸酶抑制剂(北京，全式金生物技术有限公司)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker(北京，天根生化科技有限公司)；Random Primer(N6)(日本，TaKaRa)；聚合酶链反应引物的制备来自武汉擎科公司。

1.3 实验所用主要仪器及生产公司 RT-PCR(美国，ABI)；PCR管(美国，EXTRAGENE/illumina)；微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)；微波炉(韩国，LG)；Aquapro 超级纯水仪(美国，Aquapro)；pH 计(德国，Metter-Toledo GmbH公司)；PCR仪(东胜创新生物科技有限公司)；水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；无RNase袋装吸头(美国，EXTRAGENE)。

1.4 实时定量PCR 引物序列 实时定量PCR引物序列见表1。 miRNA 反义链通用引物：CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。

表1 引物序列

1.5 Trizol法提取RNA 抽取实验对象外周血液2 mL，按照Trizol试剂盒说明书提取RNA。利用微量分光光度计测定吸光光度值，计算样品RNA 的浓度。将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。

1.6 逆转录成cDNA 根据试剂盒的说明书对RNA 进行反转录。反应体系配制见表2。实验所用的移液器吸头和离心管，均必须提早采用0.1% DEPC溶剂浸没过夜，再用高压杀菌、烘干后方可应用于本实验。

1.7 RT-qPCR 检测 将实时定量PCR 所需试剂置于冰上融解，上下轻柔颠倒使之混匀，短暂离心后将试剂放置冰上待用。根据说明书，冰上配制实时定量PCR 反应液，反应体系见表3。

表2 逆转录反应体系

表3 PCR反应体系

1.8 统计学方法 应用SPSS20.0 统计学软件进行实验数据的统计分析，计量资料不符合正态分布，采用M[P25～P75]表示，两两组间比较采用独立样本秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受检者的临床资料比较 两组受检者的年龄和白细胞计数比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，但病例组患者的血红蛋白含量和血小板计数明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

2.2 两组受检者的miR-144-3p、MAPK1mRNA表达水平比较 病例组患者的miR-144-3p mRNA和MAPK1 mRNA 的表达水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5。 miR-144-3p mRNA PCR曲线见图1，miR-144-3p的溶解曲线见图2。

表4 两组受检者的临床资料比较(M[P25～P75])

表5 两组受检者的miR-144-3p 、MAPK1 mRNA 表达水平比较(M[P25～P75])

图2 miR-144-3p的溶解曲线

3 讨论

慢性粒细胞白血病好发于中年人，是常见的血液系统恶性肿瘤。尽管酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors (TKIs)在控制CML 慢性期取得了显著的成功[5]，但由于TKIs 不能杀死白血病干细胞而导致CML 复发、耐药[6]。对大部分患者来说，CML 目前仍不能根治，进入急变期后预后更差，急需要研究发现新的针对白血病干细胞有关的发病机制及治疗手段。

miRNA 是一种非编码小RNA，具有癌基因或抑癌基因功能[7-9]。研究发现人体骨髓白血病干细胞中存在miRNA 的表达[10]，miRNA 对白血病干细胞有着重要的调控作用。已有研究证实，通过靶向BCR-ABL基因，miR-96在慢性粒细胞白血病疾病转化过程中充当肿瘤抑制因子的作用[11]。可见微小RNA 与慢性粒细胞白血疾病进展机制密切相关，而目前CML疾病进展机制不清。

MAPK 信号通路参与到CML 发病的信号通路中[12]。MAPK 亚族中的MAPK1 可调节细胞增殖、分化、凋亡和血管形成[13]，从而促进肿瘤生长与扩散。已有文献报道了各种参与调控CML相关的MAPK信号通路蛋白级联的miRNAs的潜在作用[14]。miRNA在信号通路中有靶向多个基因的能力，这使得其作用及研究复杂化。课题组前期鉴定出的miR-144 与生物体蛋白磷酸化密切相关，能稳定存在于人体体液中。文献提示：在直肠癌中，miR-144 存在低表达，并参与了丝裂原活化蛋白激酶途径，最终抑制直肠癌细胞凋亡，促进肿瘤增殖[15]。有学者通过实时定量PCR方法证实miR-144在CML急变期细胞中表达下调[16]，它参与了MAPK 信号通路，在费城染色体阳性的K562 细胞中抑制MAPK 信号通路，促进K562 细胞的凋亡[17]。推测miR-144可能成为未来的治疗靶标。

本研究通过Targetscan7.1 数据库系统查找miR-144，发现其家族包括2 个成员，即miR-144-3p、miR-144-5p。其中研究较多的是miR-144-3p，它与脑胶质瘤[18]、结肠癌[19]等细胞增殖、凋亡、疾病预后密切相关。在非小细胞肺癌中利用微阵列及RT-PCR技术证明miR-144-3p 下调，它可能是潜在的疾病标志物[20]，与患者预后有关。研究还提示，在多发性骨髓瘤中，miR-144-3p 通过靶向c-Met 抑制细胞增殖，促进凋亡[21]；在前列腺癌中，miR-144-3p 通过靶向CEP55抑制细胞增殖，诱导凋亡[22]。miR-144-3p在多种肿瘤细胞中起着重要作用。Targetscan 7.1 数据库提示miR-144-3p 可与MAPK1 基因的3'非翻译区结合，在结肠癌细胞中已经证实miR-144-3p 可以靶向抑制MAPK1，从而抑制细胞增殖扩散，并诱导结肠癌细胞凋亡[19]。推测miR-144-3p与MAPK1基因在慢性粒细胞白血病急变期也可能有潜在联系，具体调控机制不清。

查询miRBase 数据库系统，miR-144-3p 位于17号染色体上，与现有的CML 主要的发病机制t(9;22)(q34;q11)易位所不同。探索miR-144-3p 与MAPK1在慢性粒细胞白血病中的表达及调控机制有利于寻找CML未知的发病机制及新的靶向治疗手段。

本研究结果显示，病例组患者血常规中血红蛋白含量、血小板计数明显低于健康对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示在医疗过程中关注血红蛋白含量及血小板计数的改变可以协助判断慢性粒细胞白血病患者是否进入急变期，以便及时调整治疗方案。

本研究结果还显示，病例组患者的miR-144-3p mRNA 和MAPK1 mRNA 的表达水平明显低于对照组, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示miR-144-3p、MAPK1 基因参与了慢性粒细胞白血病急变期，而急变期单个核细胞中存在大量的白血病干细胞，推测miR-144-3p、MAPK1与白血病干细胞有关，可为慢性粒细胞白血病干细胞研究提供新的思路。本研究因为人体标本，研究数量少，目前尚缺少miRNA 与MAPK1 靶向作用没有验证，以及miR-144-3p 对慢性粒细胞白血病急变期单个核细胞增殖、凋亡、周期影响的实验，因此有待课题组下一步实验完成来得出更客观准确的结论。