UCF-101对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能的保护作用

程振宇，申屠华松，陈亦华，何忠平，俞北伟，王瑞权，傅斌

（1.金华市人民医院 神经外科，浙江 金华 321000；2.金华市食品药品检验检测研究所，浙江 金华 321000；3.金华市人民医院 临床医学检验科，浙江 金华 321000；4.金华市人民医院 病理科，浙江 金华 321000）

自发性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）主要由脑动脉瘤破裂引起，预后较差[1]。除脑血管痉挛和迟发性脑缺血外，早期脑损伤是导致SAH不良预后的重要原因[2]。神经细胞凋亡是SAH后早期脑损伤的重要机制之一。SAH后加剧的神经细胞凋亡可造成患者运动和认知功能障碍，影响患者预后[3]。线粒体途径是SAH后神经细胞凋亡的三条重要途径之一[4]。Omi/HtrA2是一种线粒体丝氨酸蛋白酶。细胞受到刺激后，Omi/HtrA2分子被释放到细胞质，通过增强含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）活性参与线粒体凋亡途径发挥致凋亡作用[5]。UCF-101是Omi/HtrA2特异性抑制剂，可明显减少外伤性脊髓损伤、脓毒症性脑病或脑缺血大鼠的神经细胞凋亡，显著改善神经功能[6-9]。本研究使用UCF-101腹腔注射对SAH大鼠进行治疗，旨在评价其对SAH大鼠神经细胞凋亡的抑制作用及对神经功能的改善作用，为SAH药物治疗的研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料 健康Wistar大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），雄性，清洁级，体质量250～300 g； UCF-101（规格：5 mg/支，德国Calbiochem公司）；ApoAlert细胞凋亡检测试剂盒（规格：100T/盒， 美国Biosciences Clontech公司）；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量试剂盒（美国Thermo Scientific公司）；脱色摇床（型号：TY-80B，常州澳华仪器有限公司）；转印槽（型号：Trans-Blot，美国Biorad公司）；电泳仪（型号：DYCP-31C，北京六一生物科技有限公司）；小型垂直电泳槽（型号：164-8001，美国Biorad公司）；生物倒置显微镜[型号：IX-71，奥林巴斯（中国）有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模：按照随机数字表法将90只大鼠分成Sham组、SAH组和UCF-101组，每组30只。SAH组和UCF-101组大鼠按照50 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠针麻醉后，采用ROUX等[10]建立的枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型，Sham组大鼠2次均注入等量0.9%氯化钠注射液。在手术操作前0.5 h， UCF-101组大鼠按照3.0 μmol/kg剂量给予腹腔注射UCF-101，Sham组和SAH组大鼠均按照10 mL/kg剂量腹腔注射0.9%氯化钠注射液。在24 h后，取每组各10只大鼠，处死后取少量脑组织用于神经细胞凋亡检测和Western blot检测，每组剩余10只大鼠用于神经功能检测。实验过程中，大鼠死亡后补充成活大鼠，保证每亚组10只大鼠。

1.2.2 Western blot检测：大鼠脑组织经细胞裂解、离心及BCA法蛋白浓度测定后，经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脱脂奶粉Tris生理盐水和吐温20缓冲液在室温下封闭蛋白，加入兔抗大鼠procaspase-3（1:2 000，英国Abcam公司）、procaspase-9（1:1 000，美国CST公司）、剪切聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）（1:2 000，英国Abcam公司）、caspase-3（1:2 000，英国Abcam公司）、caspase-9（1:1 000，美国CST公司）和GAPDH（1:1 000，美国CST公司）单克隆抗体孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（1:2 000，英国Abcam公司）室温摇床孵育，洗膜，化学发光试剂作用，X光胶片曝光、冲洗并扫描。采用Quality one软件分析杂交条带灰度值，以GAPDH水平为内对照，比较相对灰度值。

1.2.3 细胞凋亡检测：将大鼠脑组织进行4%多聚甲醛固定24 h后，脱水、透明、浸蜡进行包埋，作成4 μm厚度切片，60 ℃烤片3 h，切片脱蜡至水；取ApoAlert TUNEL细胞凋亡试剂盒内适量试剂 1（TdT）和试剂2（dUTP）按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37 ℃恒温箱孵育2 h，湿盒内加少量水保持湿度。切片用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤3次，每次5 min；去除磷酸盐缓冲液后在圈内滴加4，6-二脒基-2-苯基吲哚染液，避光室温孵育10 min。玻片置于磷酸盐缓冲液 （pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min， 最后用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像，计算凋亡神经细胞比例。

1.2.4 认知功能测试：参照VORHEES等[11]的方法对大鼠进行Morris水迷宫定位航行实验，在术后第1天到第3天每天3次对大鼠进行训练，在术后第4天测定大鼠逃避潜伏期。如果大鼠在规定时间120 s 内找到平台，记录这个时间作为逃避潜伏期，若在120 s内找不到平台，将其引导至平台，让其在平台上站立10 s，这时逃避潜伏期记为120 s。

1.2.5 神经行为学测试：在术后第24小时，采用KAOUTZANIS等[12]的方法对大鼠进行神经行为学测定，内容包括运动反应、睁眼反应和进食3部分，分值依次为5、4和2分，总分3～11分，11分正常，3分最差。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCF-101对SAH大鼠Kaoutzanis M神经行为学评分的影响 SAH组大鼠Kaoutzanis M神经行为学评分较Sham组显著下降（P＜0.01），而UCF-101组大鼠Kaoutzanis M神经行为学评分较SAH组显著升高（P＜0.05），见图1。

2.2 UCF-101对SAH大鼠逃避潜伏期的影响 SAH组大鼠逃避潜伏期较Sham组显著升高（P＜0.01），而UCF-101组大鼠逃避潜伏期较SAH组显著下降（P＜0.01），见图2。

2.3 UCF-101对SAH大鼠颞底皮层神经细胞凋亡相关蛋白表达的影响 SAH组大鼠颞底皮层procaspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表达较Sham组显著升高（均P＜0.01），而UCF-101组大鼠颞底皮层pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表达较SAH组显著下降（均P＜0.05），见图3。

图1 UCF-101对SAH大鼠Kaoutzanis M神经行为学评分的影响（每组n=10）

2.4 UCF-101对SAH大鼠颞底皮层神经细胞凋亡的影响 SAH组大鼠颞底皮层凋亡神经细胞比例较Sham组显著升高（P＜0.01），而UCF-101组大鼠颞底皮层凋亡神经细胞比例较SAH组显著下降（P＜0.01），见图4-5。

图2 UCF-101对SAH大鼠逃避潜伏期的影响（每组n=10）

3 讨论

细胞凋亡是一种程序化的细胞死亡方式，它的一个显著特征就是细胞染色质的DNA降解。Caspase 与真核细胞凋亡密切相关。细胞凋亡按照起始 caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路3种途径[13]。线粒体通路是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase从而激活下游信号通道诱发细胞凋亡。caspase-3和caspase-9是参与细胞凋亡线粒体通路的重要信号蛋白。细胞凋亡发生时，pro-caspase-3和pro-caspase-9生成增多，同时转化为caspase-3和caspase-9。PARP是DNA修复酶，在细胞凋亡中发挥着重要作用。PARP是caspase的切割底物。当caspase-3和caspase-9被激活时，PARP被切割成为剪切PARP，从而失去对DNA的修复功能[4]。因此，如同本研究所示，在SAH大鼠脑组织中，神经细胞凋亡加剧的同时会伴有脑组织pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表达水平的升高。当然，神经细胞凋亡的加剧势必造成神经功能的破坏，这个现象在既往研究[14-15]和本研究中也得到了论证。因此，判定SAH大鼠脑组织凋亡神经细胞及pro-caspase-3、procaspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9等细胞凋亡相关蛋白的表达可评价大鼠脑组织的损伤情况，从而反映大鼠神经功能的损伤程度。

HtrA是细菌体内一种蛋白质分子，属于丝氨酸蛋白酶家族，其含义最初是指这种蛋白质在细菌的耐热特性中发挥重要作用，即当环境温度正常时作为分子伴侣存在，环境温度升高时则作为蛋白酶，参与降解细胞质内产生的异常蛋白质。随着研究的深入，人们进一步发现其作用在于使折叠错误的蛋白质分子重新折叠或发生降解。在哺乳动物体内，目前观察到的HtrA同源物有人类Omi/HtrA2[5]。Omi/HtrA2是细胞凋亡线粒体途径中重要的信号蛋白，在内质网合成，然后由基质导入顺序/线粒体定位信号引导转运进入线粒体，在线粒体内被线粒体加工肽酶降解形成成熟的Omi/HtrA2，并储存在线粒体膜间隙中。在病理情况下，当细胞受到刺激时线粒体膜通透性增加，Omi/HtrA2从线粒体释放到细胞质，与X染色体连锁凋亡抑制蛋白结合，解除了它对caspase-9的抑制，导致下游caspase-3活化，而PARP被剪切失去活性，DNA断裂得不到修复，促成了细胞凋亡的加剧，进而引起了疾病的发生和发展[5]。在中枢神经系统，Omi/HtrA2可以促进脑损伤大鼠皮层pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表达量升高，破坏血脑屏障，从而加重脑水肿；这些证据说明，Omi/HtrA2可能通过促发神经细胞凋亡而参与了脓毒症性脑病大鼠、癫痫持续状态幼鼠和脑缺血/再灌注损伤大鼠脑损伤的发生发展过程[6-9，16-18]。

图3 UCF-101对SAH大鼠颞底皮层神经细胞凋亡相关蛋白表达的影响

UCF-101是Omi/HtrA2特异性抑制剂，通过抑制Omi/HtrA2活性从而减少对X染色体连锁凋亡抑制蛋白的降解，进而增强对caspase-9抑制作用，导致细胞凋亡的下降；UCF-101对心肌梗死、脓毒症和急性肾损伤等疾病已经发挥了较好的保护作用[19]。在动物实验阶段，UCF-101多采用腹腔注射的方式来抑制各种疾病的细胞凋亡[6-9]。而UCF-101所使用的剂量变化较大。LIU等[20]发现，UCF-101剂量在 0.6～1.8 μmol/kg范围内对心肌细胞凋亡的抑制作用呈现剂量依赖性，而1.5 μmol/kg剂量对心肌细胞凋亡的抑制作用效果最佳。在脓毒血症脑病大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的剂量是 10 μmol/kg[8]。而在两个脑缺血大鼠的研究中，UCF-101腹腔注射所使用的剂量是1.5 μmol/kg[6-7]。本研究为了提高对UCF-101对SAH大鼠神经细胞凋亡的抑制作用，在脑缺血研究[6-7]的基础上增加UCF-101腹腔注射的剂量到3 μmol/kg。本研究数据显示，SAH组大鼠脑组织pro-caspase-3、pro-caspase-9、剪切PARP、caspase-3和caspase-9蛋白表达量、凋亡神经细胞比例和逃避潜伏期较Sham组大鼠显著升高，而SAH组大鼠Kaoutzanis M神经行为学评分较Sham组大鼠显著降低；而UCF-101腹腔注射均不同程度地逆转了上述指标的变化。在脑缺血大鼠中，UCF-101腹腔注射可以显著抑制神经细胞凋亡从而改善大鼠神经功能[6-7]。在脓毒血症脑病大鼠中，UCF-101腹腔注射可以明显抑制caspase-3和 caspase-9活性及神经细胞凋亡，从而改善大鼠的认知功能[8]。本研究检测了多种细胞凋亡相关蛋白的表达，同时评价了SAH大鼠运动行为功能和认知功能，研究数据支持按照3 μmol/kg剂量腹腔注射UCF-101也可显著抑制SAH大鼠神经细胞凋亡从而改善大鼠神经功能。由于脑组织诸多细胞可以发生凋亡，而本研究没有采用NeuN共标染色凋亡细胞，可能导致所显示的凋亡细胞不全是神经元细胞。但在脑组织内，神经元细胞还是占有较大比例，因此，本研究显示的UCF-101对神经元的保护作用应该存在。当然，采用NeuN共标染色凋亡细胞对本研究的结论的严谨性具有较大的提升作用。综上所述，UCF-101对SAH大鼠神经功能具有显著保护作用，而UCF-101可能是SAH药物治疗研究的新方向。

图4 UCF-101对SAH大鼠颞底皮层神经细胞凋亡影响的代表性TUNEL荧光染色图（×200）

图5 UCF-101对SAH大鼠颞底皮层神经细胞凋亡的影响（n=10）