姬松茸多糖对LPS诱导人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护机制

陈琴，陈黎黎，周爱明，黄旭才，潘景业

（1.温州医科大学附属第一医院 重症医学科，浙江 温州 325015；2.乐清市第三人民医院 重症医学科，浙江 温州 325604）

脓毒血症是一种由病原微生物干扰引起的宿主抗感染免疫失调导致的系统性炎症反应综合征，病死率高[1]。研究表明，血管内皮细胞的炎症损伤是脓毒症引起多器官功能障碍的关键因素[2]。姬松茸多糖（agaricus blazei polysaccharide，ABP）是从优质姬松茸实体内提取的有效生物活性成分，已有研究表明其具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多种功能[4-6]。本研究以脂多糖（lipopoly saccharides，LPS）作为诱导剂，构建人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）损伤模型，观察ABP对LPS诱导的HUVECs损伤的保护作用，探讨其可能的作用机制。

图1 CCK-8法检测各浓度ABP对HUVECs细胞活性的影响

图2 各组HUVECs中TNF-α和IL-6的表达变化

1 材料和方法

1.1 材料 HUVECs购于中国科学院生命科学研究院细胞库；ABP购于丽水方格药业公司；LPS购自美国Sigma公司；COX-2、iNOS、ICAM-1，VCAM-1和GAPDH 购于美国Abcam公司；p65、p-p65、IκB、p-IκB购于美国Cell Signaling Technology公司；Cell Counting KIT-8细胞活性检测试剂盒购于日本Dojindo公司；DMEM/F-16细胞培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶购于美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：HUVECs用含10%胎牛血清、1%青-链霉素双重抗生素的DMEM/F-16培养基传代，培养于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中。细胞分组：Control组、LPS组、LPS+ABP组。Control组为单纯HUVECs培养，LPS组为单纯HUVECs培养基础上，加入终浓度为1 μg/mL LPS液。LPS+ABP组为LPS组基础上，24 h后分别加入终浓度为10、20、50 μg/mL ABP。

1.2.2 细胞毒性检测：以细胞密度为1×104/mL接种于96孔板，用0、10、20、50、100、200 μg/mL ABP处理24 h，CCK-8试剂盒检测各组细胞数。

1.2.3 ELISA检测：各组细胞恒温培养箱中培养 24 h后，检测各组细胞TNF-α、IL-6的相对含量，重复3次，具体参照ELISA试剂盒说明书操作步骤。

1.2.4 Western blot检测：LPS预处理细胞培养 24 h后，胰蛋白酶法提取各组细胞蛋白，细胞蛋白浓度测定试剂BCA法蛋白定量。Western blot检测各组细胞炎症因子、细胞黏附分子及NF-κB信号通路相关蛋白表达。

1.2.5 RT-PCR检测：RT-PCR检测各组细胞炎症因子、细胞黏附分子及NF-κB信号通路相关基因表达，具体参考试剂盒说明书上操作步骤。

图3 各组HUVECs中COX-2、iNOS的表达变化

1.2.6 免疫荧光检测：各组细胞4%的多聚甲醛溶液固定，一抗溶液充分覆盖细胞，4 ℃冰箱过夜；二抗溶液充分覆盖细胞，使用DAPI细胞核染色1 min 后，甘油封片，荧光显微镜下观察图像并拍照。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析和重复测量资料的方差分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度ABP对HUVECs细胞毒性的影响 终浓度为10、20及50 μg/mL ABP作用于HUVECs细胞24、 48 h后，其细胞增殖较空白组均无明显抑制（P＞0.05）。终浓度为100、200 μg/mL ABP作用于HUVECs 细胞24、48 h后，其细胞增殖较空白组均有明显下降（P＜0.05），见图1。因此选择10、20、50 μg/mL 3个ABP药物浓度用于后续实验。

2.2 各组HUVECs中TNF-α和IL-6的表达情况 LPS组中TNF-α和IL-6蛋白表达显著高于Control组（P＜ 0.01）；LPS+ABP组随药物浓度升高，其TNF-α和IL-6蛋白表达较LPS组呈下降趋势，20、50 μg/mL浓度组均明显低于LPS组（P＜0.05）。LPS组中TNF-α和IL-6 mRNA表达显著高于Control组（P＜0.01）；LPS+ABP组随药物浓度升高，TNF-α mRNA表达逐渐降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；50 μg/mL组IL-6 mRNA较LPS组低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图4 各组HUVECs中ICAM-1、VCAM-1的表达变化

2.3 各组HUVECs中COX-2和iNOS的表达情况 LPS组HUVECs细胞COX-2、iNOS的蛋白表达量较Control组显著升高（P＜0.01）；20、50 μg/mL浓度LPS+ABP组，其COX-2、iNOS蛋白表达较LPS组逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。LPS组COX-2、iNOS mRNA表达量较Control组显著升高（P＜0.01）；LPS+ABP组随药物浓度升高，其COX-2、iNOS mRNA表达较LPS组有下降趋势，与LPS组比，50 μg/mL LPS+ ABP组COX-2 mRNA下降明显（P＜0.05）；与LPS组比，20、50 μg/mL LPS+ABP组iNOS mRNA表达差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.4 各组HUVECs中ICAM-1、VCAM-1的表达情况 LPS组中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量显著高于Control 组（P＜0.01）；20、50 μg/mL LPS+ABP组其ICAM-1、VCAM-1蛋白表达较LPS组降低（P＜0.05）；10 μg/mL LPS+ABP组ICAM-1蛋白表达较LPS组降低（P＜0.05）。LPS组ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达量较Control组显著升高（P＜0.01）；LPS+ABP组随药物浓度升高，其ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达较LPS组逐渐下降，20、50 μg/mL浓度组均明显低于LPS组（P＜0.05），见图4。

2.5 各组HUVECs中NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 LPS组中p-p65/p65及p-IκB/IκB蛋白相对表达量显著高于Control组（P＜0.01）；10、20、 50 μg/mL LPS+ABP组p-p65/p65相对表达量较LPS组逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；20、 50 μg/mL LPS+ABP组p-IκB/IκB蛋白相对表达量较LPS组降低（P＜0.01），见图5。

2.6 ABP抑制由LPS诱导的HUVECs中p65蛋白核移位 LPS组中代表p65蛋白的绿色荧光主要集中于细胞核中；LPS+ABP组中，代表p65蛋白的绿色荧光的大部分聚集在内皮细胞的细胞质中，少部分集中于细胞核中（见箭头标注处），见图6。

3 讨论

IL-6是一种急性期反应的重要细胞因子。研究表明，IL-6及其家族成员的含量水平对疾病的预后判断有重要作用[9]。TNF-α可以促进细胞内iNOS的合成及释放，而iNOS则可以进一步促进NO的生成，最终导致炎症[10]。本研究中LPS组IL-6和TNF-α的表达显著升高，在不同浓度ABP干预后，其含量则显著下降，表明ABP可能抑制HUVECs中炎症因子的表达。

图5 各组HUVECs中NF-κB信号通路相关蛋白的表达变化

有研究报道在脓毒症小鼠模型中，血液循环中iNOS和COX-2的含量显著上升[11]。抑制iNOS和COX-2表达，可减轻炎症，缓解脓毒血症临床症状[13]。 本研究发现LPS可促进HUVECs细胞iNOS、COX-2蛋白基因表达，加入不同浓度ABP干预后可逆转上述现象，且呈剂量依赖性，表明ABP可抑制LPS诱导的HUVECs内炎症因子（iNOS和COX-2）合成与释放。

图6 各组HUVECs中p65蛋白的核移位图（免疫荧光染色，×400）

另外，LPS可诱导血管内皮细胞合成、释放ICAM-1、VCAM-1等细胞间黏附分子[14]。ZHENG等[15]研究表明，蒲公英甾醇可通过抑制LPS诱导的内皮细胞损伤中ICAM-1、VCAM-1的表达，进而发挥抗炎作用。王莎等[16]研究证明葛根素可明显减轻由LPS所致的小鼠血管内皮的损伤，机制可能与下调损伤的血管细胞间黏附分子相关。本研究显示，LPS可诱导HUVECs高表达ICAM-1、VCAM-1，而加入不同浓度ABP干预后则可逆转上述现象。可见，ABP可能通过下调ICAM-1和VCAM-1表达保护血管内皮细胞。

NF-κB信号通路是机体内重要的转录途径，研究认为细胞间黏附分子的抗炎作用可能与NF-κB信号通路的活化相关[17]。细胞内细胞间黏附分子基因的启动子上均含有NF-κB相关蛋白的对应结合位点，当外界或体内的各种刺激因素导致NF-κB信号通路被激活后，可促进细胞内各种细胞间黏附分子大量表达[18]。本研究发现，LPS可上调HUVECs细胞p-p65和p-IκB蛋白表达，而加入不同浓度ABP干预后，能以剂量依赖性的方式逆转上述现象，最终减轻炎症反应。

综上所述，ABP可能通过下调NF-κB信号通路逆转LPS诱导的HUVECs损伤。