基于NGF-TrkA通路研究电针疗法治疗粪失禁兔动物模型的作用机制*

王晓锋，崔国策，李宇飞，何颖华，智建文，周娇娇，李嘉俊,李华山

(中国中医科学院广安门医院,北京 100053)

大便失禁即肛门失禁，为排便功能紊乱的一种症状，虽不直接威胁生命，但严重干扰患者正常工作和生活，给患者造成生理和心理上的痛苦[1]。流行病学调查显示肛门失禁发生率在1.4%～18%，而在养老院人群中可达50%[2]。随着我国人口老龄化加剧，肛门失禁发生率呈上升趋势，对人类健康造成极大威胁。电针疗法是针灸与电刺激两者结合的综合方法，具有针对性强、适应证广、安全性高和医疗成本低的特点，社会反应普遍较好[3]。既往研究报道电针疗法对大便失禁有一定改善作用[4]。神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)是一种神经细胞生长调节因子，具有促进神经细胞分化、生长的作用[5]。酪氨酸激酶受体A(Tyrosine kinase receptor A，TrkA)是NGF的特异性高亲和力受体，介导NGF大多数生物功能[6]。有研究显示NGF-TrkA信号通路在神经系统病变发生发展过程中发挥重要作用[7]。目前国内有关大便失禁的基础研究较少，电针疗法对大便失禁的具体作用机制尚不清楚。本研究基于NGF-TrkA通路研究电针疗法治疗粪失禁兔动物模型的作用机制，以期为临床治疗策略提供实验依据和进一步研究线索，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

新西兰兔30只，SPF级，雄性，8月龄，购于深圳康泰生物制品股份有限公司[生产许可SYXK(粤)2018-0193]。将30只新西兰兔适应性喂养7 d后随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。

1.2 粪失禁兔动物模型制备

取模型组和治疗组新西兰兔，按30 mL/kg耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(湖北鸿运隆生物科技有限公司)予以麻醉，麻醉成功后固定实验兔，骶尾部剃毛，常规消毒，取Kimberly-Clark专用穿刺针(上海爱泽工业设备有限公司)于第4荐神经的解剖部位穿刺，穿刺到位后将穿刺针针芯更换射频针针芯，选择射频治疗仪(加拿大Baylis公司，型号：PMG-230)按键中的CURRENT键，增大电流直至实验兔肛门出现抽搐、收缩，观察电流值0.6～1.0 mA时开启热凝射频治疗模式(时间设定：90 s，温度设定：85℃)，开始射频能量传输，操作完成后，待射频针温度<40℃时再次传输射频能量。术后14 d时测定肛门静息压<15 mmHg即为造模成功。

1.3 干预方法

造模成功后，对照组和模型组不作任何干预，治疗组采用电针治疗。电针治疗步骤：针刺双侧中髎(骶部髂后上棘内下方，第3骶后孔处，直刺15 mm)、单侧三阴交(后肢内踝尖直上方3 cm处，直刺2 mm)、单侧足三里(后肢膝关节前处稍下方，腓骨小头下2.5 cm，直刺10 mm)，针刺后连接电针治疗仪(广州市美强医疗科技有限公司，型号：XS-998B)，双侧中髎一组，三阴交与足三里一组。刺激参数：持续波，频率10 Hz，脉宽200 μs，取穴为同一侧。隔日治疗1次，每次20 min，连续治疗3个月。

1.4 评价指标

1.4.1 肛门静息压 于治疗结束测定各组新西兰兔肛门静息压，操作如下：固定各组新西兰兔，打开消化道动力测定仪(广州市瑞桥贸易有限公司，型号：XDJ-S8G)，初始化完成后测压管道注水、调零，实验兔肛门内插入测压管3 cm，按下“取值键”读取数值，缓慢退出测压管，每隔1 cm读取数值，共读取3次，取平均值。

1.4.2 肛门括约肌组织形态学变化 各组新西兰兔肛门静息压测定完成后，处死5只，取其肛门括约肌组织，用10%甲醛溶液(上海钰博生物科技有限公司)固定，梯度酒精(北京宏昌信科技有限公司)脱水，二甲苯(上海麦克林生化科技有限公司)透明，石蜡包埋成块，采用组织切片机(上海精密仪器仪表有限公司，型号：McIlwain)切成5 μm连续切片，脱蜡水化，采用HE染色试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)染色，流水冲洗，烘片0.5 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固封剂(天津百伦斯生物技术有限公司)封片，采用光学显微镜(北京中西远大科技有限公司，型号：SH11/YF-9)观察HE染色结果。

1.4.3 肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量 HE染色完成后，处死剩余5只新西兰兔，取其肛门括约肌组织，剪碎，加RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)，置于组织匀浆器(北京海德创业生物科技有限公司)中，10 000 rpm离心5 min，取上清，使用BCA试剂盒(上海炎熙生物科技有限公司)测定蛋白质浓度。取总蛋白上样，电泳，切胶，转至PVDF膜上，选择湿转，TBS-T 25℃封闭1 h，加入NGF一抗(1∶500)(上海优宁维生物科技股份有限公司)、TrkA一抗(1∶300)(湖南远泰生物技术有限公司)、GAPDH一抗(1∶400)(深圳欣博盛生物科技有限公司)，4℃摇床过夜，PBST洗膜，加二抗(1∶2 000)(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，4℃摇床过夜，PBST洗膜，ECL发光试剂盒(上海硕嘉生物科技有限公司)显色、显影，以GAPDH为内参蛋白，用Image Quant TL软件分析各条带的灰度值。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组新西兰兔肛门静息压比较

模型组新西兰兔肛门静息压显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组新西兰兔肛门静息压显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组新西兰兔肛门静息压显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组新西兰兔肛门静息压比较

2.2 各组新西兰兔肛门括约肌组织形态学变化

对照组新西兰兔肛门括约肌组织形态结构正常，肌纤维连续完整，括约肌厚度、固有层厚度、肌纤维数量均正常；模型组新西兰兔肛门括约肌组织形态结构异常，括约肌全层变薄，固有层结缔组织变厚，肌纤维数量明显减少、变细、断裂，横纹肌致密程度明显下降；治疗组新西兰兔肛门括约肌组织形态结构较模型组明显改善，括约肌全层变厚，固有层结缔组织变薄，肌纤维变粗并趋于完整，肌纤维数量增多，横纹肌致密程度增加。见图1。

注：A为对照组，B为模型组，C为治疗组。图1 各组新西兰兔肛门括约肌组织形态学变化(HE染色，100×)

2.3 各组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量比较

模型组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量比较

图2 各组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量

3 讨论

大便失禁是指肛门括约肌对气体及粪便控制能力减弱或消失，粪便不自主地排泄，至少持续3个月。长期大便失禁会使肛周皮肤受溢出粪便反复刺激，使皮肤处于潮湿和代谢产物侵蚀状态，造成压力性溃疡、会阴部皮炎和骶尾部皮炎等，严重影响患者健康水平与生活质量。大便失禁常见病因包括肛门直肠畸形、解剖结构损伤(结肠肛管吻合术、低位前切除术等)、神经系统病变(脑梗死、脊髓结核和运动性共济失调等)、直肠平滑肌病变和粪便成分异常(肠易激综合征、感染性腹泻)等[8]。目前大便失禁治疗方法繁多，治疗效果尚不确切，作用机制仍不清楚，因此有必要开展基础实验研究，为大便失禁发生机理和临床治疗奠定基础。

电刺激疗法是采用低频脉冲电刺激脊髓神经，使患者恢复身体机能，有效提高生活质量。近年来电刺激疗法已广泛应用于瘫痪、脊柱侧凸和胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease，GERD)等疾病[9-11]。针灸是我国特有的治疗疾病的手段，为中医学的一个重要组成部分，主要通过经络、腧穴的传导作用达到治疗全身疾病目的，其作为补充和替代疗法在西方国家也吸引了越来越多的关注[12]。电针疗法是针灸与电刺激两者结合的综合方法，具有针对性强、适应证广、安全性高和医疗成本低的特点。有研究证实电针疗法具有兴奋性和抑制性的双向调节作用，可通过促进肛门括约肌收缩改善机体排便功能[13]。中医临床实践证实电针疗法对脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)后神经源性膀胱有确切疗效[14]。本研究选择主治大小便不利的中髎、三阴交、足三里3个穴位进行电针治疗，发现模型组新西兰兔肛门静息压显著低于对照组，治疗组新西兰兔肛门静息压显著高于模型组，这与既往研究报道一致，提示电针疗法对大便失禁有一定改善作用[4]。本研究HE染色显示治疗组新西兰兔肛门括约肌组织形态结构较模型组明显改善，括约肌全层变厚，固有层结缔组织变薄，肌纤维变粗并趋于完整，肌纤维数量增多，横纹肌致密程度增加，由此提示电针疗法可有效改善大便失禁实验兔肛门括约肌组织病理改变。NGF是一种神经细胞生长调节因子，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，并在中枢及周围神经元发育、分化、生长和再生过程中有重要的调控作用。此外NGF还能调节免疫系统功能，抑制肿瘤有丝分裂，促进创口组织修复反应。酪氨酸激酶受体(Tyrosine kinase receptor，Trk)由细胞外、跨膜及细胞内三部分组成，具有酪氨酸蛋白激酶活性，其可使位于膜内区段上的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase，TPK)激活，使自身肽链和膜内蛋白底物中的酪氨酸残基(Tyrosine residue，PTYR)磷酸化，从而将细胞内信息传递到细胞外，导致基因转录过程改变及细胞内相应的生物学效应。TrkA是NGF的特异性高亲和力受体，能够介导NGF一系列生物学效应[15]。相关研究表明NGF-Trk A信号通路与肿瘤增殖、血管生成和神经系统生长发育相关[16]。既往研究显示电针可以促进脑缺血损伤大鼠海马组织中TrkA表达，从而减少脑缺血诱导的神经元凋亡[17]。本研究显示模型组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量显著低于对照组，治疗组新西兰兔肛门括约肌组织中NGF、TrkA蛋白表达量显著高于模型组，电针疗法可能通过激活NGF-TrkA信号通路对粪失禁兔动物模型起到改善作用，这可为临床大便失禁的治疗提供新的思路。

综上所述，电针疗法可能通过激活NGF-TrkA信号通路对粪失禁兔动物模型起到改善作用，这可为临床治疗大便失禁提供理论依据。但本研究时间较短，仍有待进一步研究。