电针对2型糖尿病ZDF大鼠骨骼肌PI3K p85和GLUT4表达的影响*

2020-11-28 07:25金永祚曹昺焱张婧怡宋姗姗金奉奎
针灸临床杂志 2020年10期
关键词:胃脘骨骼肌电针

金永祚,曹昺焱,李 瑞△,张婧怡,宋姗姗,金奉奎

(1.北京中医药大学,北京 100029; 2.中国中医科学院西苑医院,北京 100091)

糖尿病患病人数日趋增多,中国的2型糖尿病(T2DM)流行病学调查结果显示,成人T2DM患病率为10.9%,40岁以下患病率高达5.9%,发病已有年轻化倾向[1]。T2DM是以高血糖症为主要特征并伴胰岛素抵抗(IR)或胰岛素相对分泌障碍的慢性代谢性疾病。其中IR贯穿于T2DM病程的所有阶段,在疾病的发生和发展中起着重要作用。IR的发生主要涉及骨骼肌、脂肪、肝脏组织。其中骨骼肌摄取约80%的葡萄糖,是维持恒定血糖平衡和利用葡萄糖的重要组织[2],因此骨骼肌在IR中占有至关重要的地位。胰岛素主要通过磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)信号途径进行代谢调节,该途径与IR相关的T2DM具有密切关系。因此从骨骼肌的PI3K信号途径探究针刺改善胰岛素抵抗的分子机制有重要意义。西医对糖尿病的治疗主要采用口服降血糖药和注射胰岛素,但使用剂量或用药不当会出现低血糖,长期服用降血糖药有损害肝肾功能的危险,难以避免副作用[3]。糖尿病是当前公共健康所面临的重大问题,已被确定为代谢疾患重点疾病。针刺疗法属于非药物疗法的中医学方法之一,其具有多方面优势而无副作用,并已大量实验表明电针对IR有一定的改善作用[4]。故本实验通过电针治疗自发性2型糖尿病ZDF大鼠,观察其对骨骼肌中PI3K之亚基p85和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

实验动物为7只体质量140~160 g(2月龄)的SPF级雄性ZL(fa/+)(Zucker Lean)大鼠以及14只同月龄SPF级雄性ZDF(fa/fa)(Zucker Diabetic Fatty)大鼠。全部动物购自北京维通利华公司。动物于23 ℃、空气流通、相对湿度60%、12 h昼夜循环光照的条件下饲养。实验于4周诱导饲养后开始进行,适应性饲养期间,如无特殊需要,动物自由饮食水。按北京维通利华公司建议,在诱导饲养及成模后干预期间,全部动物均以Purina #5008饲料喂养。

1.2 动物饲料

Purina #5008饲料(组成:粗蛋白≥23.0%,粗脂肪≥6.5%,粗纤维≤4.0%,粗灰分≤10%,水分≤11.0%,磷≥0.65%,钙0.75%~1.25%;原料组成:玉米粉,脱壳大豆粉,小麦粉,鱼粉,麦麸,啤酒酵母,蔗糖蜜,麦芽,甜菜粉,燕麦粉,大豆粉,脱水苜蓿草粉,大豆壳粉,矿物质和维生素)。

1.3 实验耗材及试剂

罗氏ACCU-CHEK血糖仪(LOT 10129770,罗氏血糖健康医护公司);罗氏血糖试纸(LOT 24685431,罗氏血糖健康医护公司);大鼠[许可证号SCXK(京)2016-0006,北京维通利华实验动物技术有限公司];中研太和牌针灸针0.13 mm×7 mm (212161123,北京中研太和医疗器械有限公司);兔Anti-PI3K p85抗体(Cell Signaling);鼠Anti-GLUT4抗体(Cell signaling)。

2 试验方法

2.1 动物分组

ZDF大鼠诱导饲养4周后,以空腹血糖(FBG)均>11.1 mmol/L为成模标准。成模的ZDF大鼠依空腹血糖排序随机区组分为两组:模型组,电针组。7只ZL对照大鼠作为对照组。

2.2 治疗

2.2.1 对照组及模型组 不干预。

2.2.2 电针组 将动物固定于可伸出四肢的棉布鼠套静置5 min,以0.13 mm×7 mm针灸针(中研太和牌无菌针灸针)针刺双侧“后三里”“三阴交”“脾俞”“胃脘下俞”。后三里位于大鼠后肢膝关节外下方当膝骨小头下5 mm;三阴交位于大鼠后肢内踝尖直上10 mm;胰俞位于第8胸椎棘突下旁开7 mm;脾俞位于第11胸椎棘突下旁开7 mm[5]。直刺深度4~6 mm。连通电针仪(电针一端连接于“胃脘下俞”,一端连接同侧“后三里”,形成回路),连续波,频率15 Hz,电流输出强度2 mA,以大鼠肌肉轻微抖动而不叫为宜,留针20 min,每周6次(周一至周六),4周。以上各种干预操作均于每日13:00—18:00期间进行,连续干预4周。干预第4周周六晚20:00禁食,周日早8:00检测空腹血糖。

2.3 样本采集及指标检测

所有动物于全部干预结束后,自由饮食水,于实验结束当晚22:00禁食,次日早8:00以2%戊巴比妥钠溶液按照45 mg/kg的药量比腹腔注射麻醉,取部分大鼠股四头肌,置于-80℃冰箱中保存,用于Western blot法检测PI3K p85和GLUT4蛋白表达(所有组织均取自动物同一部位)。

2.4 Western blot法检测骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表达

依据末次干预后空腹血糖数据,每组随机抽取3样本,每样本取100 mg骨骼肌,加入1 mL含蛋白磷酸酶抑制剂的裂解液于研磨器中匀浆后,冰上静置30 min(期间每5 min涡旋振荡1次),4℃环境10 000 rpm离心15 min,提取上清液配平并煮沸(95℃,5 min)变性后,上样,电泳(浓缩胶部分电泳条件80 V,30 min);分离胶(浓度10%)部分电泳条件120 V,60 min。以80 V、70 min的条件将蛋白湿转至0.45 μm孔径的PVDF膜上,5%脱脂奶粉的TBST封闭,40 r/min室温孵育1 h,加入一抗,40 r/min室温孵育1 h后,于4℃环境下孵育16 h。此后经洗膜,二抗孵育后,于暗室曝光。数据处理:以Image J软件计算条带IOD(Integrated option density,总灰度值)作为表达量。以GAPDH为内参,计算骨骼肌中PI3K p85和GLUT4相对表达。

2.5 统计分析

所有数据以均数±标准差的形式表示,应用统计软件SPSS 21.0进行分析,采用单变量统计检验方法比较不同组别样本的差异。对于正态分布的数据,采用 ANOVA(多组检验)和Student’s t-test(两组检验)进行分析; 对于非正态分布的数据,采用Kruskal-Wallis H-test(多组检验)以及Mann-Whitney U test(两组检验)进行分析。

3 实验结果

3.1 各组大鼠空腹血糖水平

予4周诱导高质高糖Purina #5008饲料喂养4周后与对照组对比,造模后模型组大鼠和电针组大鼠的FBG显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01),模型组大鼠的FBG与电针组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),表明造模成功。

干预4周后与对照组比较,模型组和电针组血糖仍然显著升高(P<0.05),但电针组与模型组对比,明显降低了FBG的数值,且差异有统计学意义(P<0.05)。

干预4周后与造模后组内对比,对照组无统计学意义;模型组的FBG较造模后FBG显著升高,且差异有统计学意义(P<0.01),但电针组干预4周后的FBG与造模后对比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 干预前与治疗后各组大鼠FBG比较

3.2 各组大鼠骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表达量比较

与对照组大鼠相比,模型组大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组大鼠比较,电针组大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表达显著升高(P<0.01),且差异有统计学意义。说明电针可调节胰岛素信号通路上关键分子PI3K p85、GLUT4。 见图1、表2。

注:A组.对照组;B组.模型组;C组.电针组。图1 各组PI3K p85、GLUT4蛋白表达情况(Western blot法)

表2 各组PI3K p85、GLUT4蛋白表达量比较

4 讨论

T2DM属于中医学“消渴”“消瘅”范畴,主要病机为脾肾亏虚、阴虚燥热,据此确立健脾补肾、益气养阴为治疗原则。故采用李瑞老师丰富临床经验而总结的穴组结合电针治疗方法,穴组以足三里、三阴交、脾俞和胃脘下俞为主穴,《针灸甲乙经·五气溢发消渴黄疸第六》曰:“热中,消谷善饥……足三里主之。”足三里为足阳明胃经之合穴,足阳明之脉气由此处合入,可补脾胃之气,使气津两生,津液得以敷布而治疗消渴。三阴交为肝脾肾之交会穴,疏调足三阴之经气,滋阴健脾、益气补血、调补肝肾。脾俞和胃脘下俞皆属于背俞穴,调整与其相应的脏腑功能,可疏通脏腑之气,恢复其正常功能。胃脘下俞又称为胰俞。《千金方》曰:“消渴,咽喉干,灸胃脘下输三穴各百壮。”而观察电针不同穴位对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响,结果表明胃脘下俞较其他穴位降糖效果更优[6]。因此该穴组共用,可标本兼治,有健脾益肾、益气养阴之功效。

骨骼肌为维持机体糖代谢的核心组织,其主要机制为通过对葡萄糖的吸收及糖原分解来维持恒定的血糖水平,在生理情况下,胰岛素与骨骼肌细胞膜上的胰岛素受体(InR)的α亚基结合,使InR的β亚基发生自身磷酸化,而胰岛素受体底物-1(IRS-1)发生酪氨酸磷酸化。其与PI3K的p85调节亚单位相结合后催化p110,激活PI3K,并生成3磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。而其与PI3K依赖性激酶-1(PDK-1)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(AKT)的PH结构域结合,从而激活PDK-1,使AKT磷酸化被激活。AKT调节骨骼肌内的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位,可使胰岛素的生物活性得到激活,从而正常进行葡萄糖的摄取,最终完成葡萄糖的转运[7]。GLUT4在骨骼肌组织中广泛表达,在细胞表面数量增多,得到葡萄糖的摄取能力增强。故其在调节胰岛素刺激的骨骼肌组织的葡萄糖转运中起着核心作用,是预防高血糖的关键性分子[8]。PI3K在缓解IR中调节机体对胰岛素敏感性和糖脂代谢中起着重要作用[9],有研究提示,在敲除机体的PI3K p85基因后会出现严重的糖脂代谢紊乱[10]。另外研究提示氧化应激引起PI3K表达量减少,从而阻碍胰岛素信号传递[11]。故胰岛素信号通路中出现障碍,骨骼肌对胰岛素信号敏感性降低,而无法正常摄取及利用葡萄糖,最终引起血糖升高。因此该途径在2型糖尿病发病中十分重要。

本研究采用了自发型T2DM模型ZDF大鼠,该模型值得较为完整的复制人类T2DM的发病过程,针对IR主要信号转导PI3K途径进行研究。

本实验对ZDF模型大鼠电针干预4周,检测FBG的水平,电针组干预前与干预后比较FBG的水平,差异无统计学意义,但干预后电针组较模型组均有明显降低(P<0.05),提示该穴组具有改善糖代谢作用。Western blot检测各组间骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表达水平,模型组大鼠骨骼肌的PI3K p85、GLUT4蛋白表达均较对照组有明显降低(P<0.01),表明模型组大鼠骨骼肌内存在胰岛素信号传导障碍,但电针组干预可使其显著上调(P<0.01)。PI3K、GLUT4为胰岛素受体结合后的主要下游因子,通过PI3K通路导致一系列级联反应的发生,故胰岛素抵抗发生时PI3K通路活性会降低。由此结果提示电针能改善ZDF大鼠葡萄糖代谢及胰岛素抵抗,是通过提高PI3K信号途径中PI3K p85蛋白活化而激活PI3K,增加GLUT4蛋白表达和转位,促进大鼠骨骼肌的葡萄糖吸收及利用。

综上所述,李瑞老师经验穴组结合电针干预可有效控制ZDF大鼠血糖,改善骨骼肌细胞的胰岛素抵抗,其机制可能是通过PI3K、GLUT4通路来实现。本研究有望作为电针干预与其通路作用的理论依据,但糖尿病是全身系统疾病,需要更多样本对更多靶器官及与上游因子的关系进一步阐明。

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