毫针针刺和穴位注射对去卵巢大鼠骨质疏松骨代谢影响的实验研究*

洒玉萍，张广梅，赵协慧，王树林，李菊英，武 娟

(青海大学，青海 西宁 810001)

伴随着社会老龄化进程，有报道称我国老龄人口预计到本世纪中叶，将达到2.5亿，可能患有骨质疏松症(OP)的概率为25%～70%[1]。针灸对绝经后骨质疏松症领域的临床研究报道较多，机理研究尚显不够完善和系统，尚未见不同治疗方法之间的比较。本实验采用去卵巢骨质疏松大鼠模型进一步观察针灸抗绝经后骨质疏松作用机理，初步比较毫针针刺和穴位注射不同方法的作用，对于针灸临床防治骨质疏松症提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3月龄、体质量(200±20)g SD未孕雌性大鼠32只，由甘肃中医药大学科研实验中心提供，合格证号：NO62001000000326。

1.1.2 主要试剂与仪器 血清抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5,批号L170904287)、骨碱性磷酸酶(ALP，批号L170904292)、血清骨钙素(BPG,批号L170803331)均购自武汉公司;骨肽注射液由安徽宏业药业有限公司生产(批号170530，规格是2 mL∶10 mg×10支)。多功能酶标仪(型号：Infinite M200，瑞士);高速离心机(型号：TG16-WS,湖南湘仪)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型制备 SD大鼠适应1周，清洁级-架式分笼-标准饲料饲养，自由饮水。随机分为空白对照组8只和造模组24只。具体方法按照前期试验方法，进行大鼠模型制备[2]。摘除卵巢后5 d，逐只进行阴道检查，每天1次，连续5 d，无动情周期变化，证明去势成功。

模型成功建立后，将其随机分为模型组、针刺组与穴位注射组，每组各8只。

1.2.2 干预方法 穴位选择：悬钟、肾俞(均为双侧)，分别进行毫针针刺与穴位注射干预。取穴依据《实验动物针灸穴位图谱》定位。

干预方法：造模成功后1个月开始处理。针刺组：选用0.35 mm×25 mm毫针，皮肤常规消毒，进针后用捻转补法1 min，不留针，1次/d，10次一疗程；穴位注射组：皮肤常规消毒后，选用一次性注射器，型号：1 mL，抽取骨肽注射液，回抽无血后注射药物，0.2 mL/穴，隔天1次，5次为一疗程；疗程间隔2 d，共5个疗程；空白组和模型组仅施行相同的捉抓刺激。

1.2.3 检测指标与方法 实验结束、禁食12 h后取材。用10%水合氯醛按0.1 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉后取材。腹主动脉取血，离心3 000 r/min，取上清液，用移液器分别移入已备好的0.5 mLEp管中，标记后置于-80℃保存待测，其中对照组2只大鼠麻醉后采血时死亡，取血失败。骨组织形态观察：取大鼠左侧股骨，经4%组织固定液固定,石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察骨组织形态。免疫酶联法测定血清抗酒石酸酸性磷酸酶(ACP5)、骨碱性磷酸酶(ALP)和血清骨钙素(BGP)含量，严格按说明书操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 骨组织形态学观察

2.1.1 空白组 皮质骨结构致密，骨髓腔中充满大量正常的骨髓细胞。骨小梁的连接正常，有破骨细胞，骨膜清晰，骨密质层次正常。见图1A。

2.1.2 模型组 骨小梁结构正常，骨小梁弥漫变细、断裂，骨髓腔中充满大量正常的骨髓细胞。见图1B。

2.1.3 针刺组 骨小梁结构正常，骨小梁部分区域仍有变细、断裂(较模型组有改善)，骨髓腔中充满大量正常的骨髓细胞。见图1C。

2.1.4 穴位注射组 骨小梁结构正常，骨小梁少部分区域仍有变细、断裂(较模型组有明显改善)，骨髓腔中充满大量正常的骨髓细胞，骨小梁内形成板层结构。见图1D。

2.2 毫针针刺与穴位注射对各组大鼠骨代谢水平的影响

模型组大鼠的血清ACP5较空白组显著升高(P<0.01)。经毫针针刺和穴位注射干预后，与模型组比较,两组大鼠的血清ACP5含量均明显降低(P<0.05)，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注：A为空白组，B为模型组，C为针刺组，D为穴位注射组。 图1 骨组织形态学观察(100×)

表1 针刺、穴位注射对ACP5、ALP和BPG影响的表达

模型组大鼠的血清ALP较空白组显著下降(P<0.01)。经毫针针刺和穴位注射干预后，两组大鼠的血清ALP含量均明显升高,与模型组比较P<0.01，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

模型组大鼠的血清BPG较空白组显著降低(P<0.01)。毫针针刺和穴位注射干预后，两组大鼠的血清BPG含量均明显升高(与模型组比较P<0.05)，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05),但两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 大鼠血清性激素变化比较

与空白组比较，模型组大鼠FSH显著升高(P<0.05)，经毫针针刺和穴位注射干预后FSH水平下降；针刺组和穴位注射组之间FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)；与空白组比较，模型组大鼠E2水平下降，经毫针针刺和穴位注射干预后E2升高，但各组之间E2水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清E2、FSH结果

3 讨论

伴随老龄化社会发展，OP是我国民众面临的重要健康问题，且随着年龄增长OP发病风险显著增加。绝经后骨质疏松症(PMOP)，表现为以进行性骨丢失、骨脆性增加和骨折风险增加为特征的全身性疾病，属于原发性骨质疏松症，形成与停经后卵巢分泌雌激素水平低下，进而骨吸收功能强与骨形成功能有关。研究显示，我国50岁以上女性OP患病率为20.7%，男性为14.4%，发病率呈增长趋势[3]。去除卵巢造成的骨质疏松症模型可以很好模拟绝经后骨质疏松症，一般认为肾虚是其病机关键。因为卵巢功能衰退引起性激素水平的波动，可出现脂肪代谢与分布异常、体质量增加为表现的肥胖[4]。而研究发现针刺可改善下丘脑-垂体-卵巢轴、植物神经功能及血管舒缩功能，纠正能量代谢紊乱[5]，进而提高卵巢功能。中医古籍中，虽无骨质疏松症的病名，但其临床表现和中医学“骨痿”“骨枯”“骨痹”相似。肾被称为“先天之本”，肾精肾气的充盈直接影响骨的生长和发育。认为肾主骨生髓，若肾虚则骨髓化源不足，骨骼失养就会脆弱无力，患者可以出现腰酸腿软、骨骼疼痛、头晕目眩和遗精盗汗等临床表现，可见肾虚是骨质疏松症病机的关键[6-7]。

本实验中去卵巢后模型大鼠血清FSH、E2的变化与人类绝经期激素水平变化吻合，表现为FSH水平的上升、E2水平的降低。且另有研究随着性激素的改变，出现大鼠体质量上升，子宫萎缩，其重量和指数降低，经针刺与穴位注射肾俞穴、悬钟穴后，表现为大鼠的体质量下降,与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01),子宫的重量及指数增加,与模型组差异有统计学意义(P<0.01)。且毫针针刺及穴位注射干预后大鼠血清FSH水平下降、E2水平升高，对大鼠性激素有调节作用，但两组之间差异无统计学意义。

ALP是成骨细胞分化的特异性标志之一，可以从ALP 的活性看出成骨细胞的活跃状况[8]。ACP5 的活性反映骨吸收的能力，而血清中BPG的水平可以反映成骨细胞的活动，也可反映骨吸收作用[9]，其浓度与骨密度呈显著负相关。

本实验中，通过对大鼠骨形态学变化观察发现，与空白组比较，模型组的骨小梁弥漫变细、断裂,且模型组的ACP5水平明显升高、ALP与BPG含量显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)，说明骨吸收活跃而骨形成减弱，与绝经后骨质疏松症骨转换率增高的特点吻合，说明去卵巢骨质疏松症模型建立成功。经毫针针刺和穴位注射干预后 ACP5水平下降、ALP与BPG水平升高,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。光镜下观察大鼠股骨形态，毫针针刺组和穴位注射组仍可见骨小梁变细、断裂，但程度较模型组改善。说明毫针针刺和穴位注射肾俞、绝骨二穴均可调节去卵巢大鼠ALP、ACP5和BPG水平(P<0.05)，改善骨组织形态，具有益髓壮骨作用。

悬钟穴是八会穴之髓会。骨者髓之府，骨者髓所养，髓藏于骨中并充养骨骼，因此悬钟穴可以补髓壮骨，治疗骨痿、腰酸胫软等病症。肾俞是肾的脏腑经气输注到背腰部的特定位置，可以补肾填精壮腰，善于治疗脏腑疾患[10]。本实验结果表明，毫针针刺、穴位注射悬钟穴、肾俞穴可通过疏肝补肾、益髓壮骨作用对去卵巢骨质疏松症模型大鼠的生殖内分泌进行调节，并对骨代谢有一定调节作用。

针灸作为绿色疗法，在缓解骨质疏松引起的腰背肌肉疼痛、疲劳等慢性病症的同时，无服用药物引发胃肠道不适等不良反应，并且有良好的临床疗效[11-12]，本实验可为针灸临床预防和治疗骨质疏松症提供参考。