水盐胁迫下棉花叶片光合的气孔与非气孔限制

Mounkaila Hamani Abdoul Kader ，申孝军，陈津赛 ，王广帅，高 阳*

（1.中国农业科学院 农田灌溉研究所，河南 新乡453002；2.中国农业科学院 研究生院，北京100081）

0 引 言

【研究意义】光合作用是植物利用光能固定大气中的CO2合成有机物的过程，但其常受生物和非生物胁迫的抑制[1]。干旱和盐胁迫是我国西北干旱高盐区重要经济作物—棉花遭受的主要非生物胁迫，严重制约了棉花的稳产和高产。因此，研究水盐胁迫对棉花叶片光合的影响，对于揭示棉花的抗逆机制、确保棉花高产与稳产都具有重要的理论意义和实践价值。【研究进展】植物的光合作用对干旱胁迫的反应十分敏感，通常情况下，干旱程度越高，植物光合速率越低；然而，不同植物的生理和生态特性对干旱胁迫的响应也不尽相同[2]。Casson 等[3]认为气孔调节是植物抵御干旱胁迫和适应环境的机制之一。植物通过控制气孔的开闭程度和密度来调节叶片的蒸腾与光合速率，且不同植物的气孔在应对不同程度干旱时表现不同[4]。盐胁迫对植物光合过程的影响非常复杂，已有研究表明盐胁迫抑制植物叶片光合过程主要包括气孔限制和非气孔限制2 个方面[5-8]。自Grassi 等[9]提出量化光合限制分析方法后，常被用于植物光合限制因子分析。Tosens 等[10]与Wang 等[11]指出气孔限制和叶肉限制是干旱胁迫影响植物光合的主要因子，而江晓慧等[12]认为随盐分量的增加，光合限制因素由叶肉因素转变为光合机构受损。【切入点】目前，关于水盐胁迫抑制植物叶片光合速率主要由气孔限制还是非气孔限制仍没有形成统一的结论，也有研究认为是气孔因子和非气孔因子共同作用的结果。【拟解决的关键问题】因此，基于Grassi 等提出光合抑制因子量化方法，研究水盐胁迫对棉花叶片光合速率的影响，量化不同光合抑制因子对棉花光合速率的贡献。可为揭示植物光合过程对水盐胁迫的响应及其环境适应机制提供参考，也可为植物耐逆缓减技术创建提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2019 年3—6 月在中国农业科学院七里营综合试验基地的人工气候室进行（35.09°N，113.48°E）。以‘新陆中37’为供试棉花品种。对籽粒饱满且大小均匀的棉花种子进行消毒处理后，将种子播撒于装有900 g 细沙（直径0.5～0.8 mm）的PVC 桶（直径6 cm，高40 cm）内，每个桶浇水200 mL。人工气候室的温度设为25 ℃/20 ℃，湿度为40%～50%，光照时长为12 h（08:00—20:00），植株上方的光量子通量为600 μmol/（m2·s）。种子萌发后，每3～5 d 浇水50 mL 以保证水分充足，幼苗生长至1 叶期时，开始浇Hoagland 营养液，营养液5 d 浇1 次，每次100 mL，以保证棉花处于水分充足状态。Hoagland 营养液的配方为1 180 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、506 mg/L KNO3、136 mg/L KH2PO4、693 mg/L MgSO4。幼苗生长到3 片真叶时，开始进行水盐胁迫处理。试验共设4 个处理：T1 为对照，无水分和盐分胁迫；T2 为水分胁迫，灌水量为T1 的60%；即T1 处理每5 d 浇营养液100 mL，T2 处理每5 d 浇营养液60 mL。T3 为盐分胁迫，T4 为水盐胁迫处理；盐溶液的NaCl 物质的量浓度为150 mmol/L，T3 处理每5 d 浇无盐营养液40 mL 与含盐营养液60 mL，而T4 处理每5 d 只浇含盐营养液60 mL。胁迫18 d 后，选取最新完全展开叶进行各项指标的测定。

1.2 叶片光合速率与响应曲线测定

采用Li-6400XT 便携式光合测定仪观测棉花叶片的光合参数，测定的光强固定为1 200 μmol/（m2·s），CO2摩尔分数固定为400 μmol/mol，每个处理重复3次。测定CO2响应曲线时，叶室的光强设为1 000 μmol/（m2·s），CO2梯度设为400、300、200、100、50、400、400、600、800、1 000、1 200、1 600、1 800和2 000 μmol/mol；测定光响应曲线时，CO2摩尔分数设为400 μmol/mol，光强梯度设为1 800、1 600、1 500、1 400、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20 和0 μmol/（m2·s）。

1.3 叶片叶绿素荧光参数测定

使用MINI-PAM 荧光仪测定相同叶片的叶绿素荧光参数。采用暗适应夹对叶片进行暗适应处理30 min，测定棉花叶片最大荧光（Fm）、可变荧光（Fv）、光化学猝灭、非光化学猝灭、PSII 的最大光化学效率等参数。测定荧光动力学曲线时，将叶片用暗适应夹具进行暗处理20 min 以上，设置光化光照时间和荧光动力学曲线延迟时间，光化光强设置为 420 μmol/mol，然后测量荧光动力学曲线。

1.4 叶片气孔特征、叶水势与色素量测定

将棉花叶片上表皮撕取下后，去掉叶肉组织，制成玻片。在OLYMPUS显微镜40倍目镜下观察拍照，采用ImageJ1.4.8 软件进行处理分析。采用WP4C 露点水势仪测定棉花叶片的叶水势。光合和荧光测定结束后，采集各处理的叶片样品，参照Lichtenthaler等[13]的方法进行叶绿素和类胡萝卜素量的测定，每个处理设3 次重复。

1.5 数据分析

光合系统II 的光化学效率（ΦPSII）由式（1）计算得出：

式中：Fm′和FS分别为最大荧光和稳态荧光。

电子传递速率（Jf）计算式为：

式中：PPFD 为叶片上方的光强，1 000 μmol/（m2·s）；α 为叶片吸收系数；β 表示吸收的光量子在光合系统I 和II 间的分配。α 和β 分别取值为0.84 和0.5[14-15]。

采用变量J 法计算叶肉导度（gm）[16]：

式中：Ci为胞间CO2浓度（µmol/（m2·s））；Γ*为叶绿体CO2摩尔分数补偿点（µmol/（m2·s），Rd为光照下线粒体呼吸，即暗呼吸速率（µmol/（m2·s）。Γ*计算式为：

式中：C 为常数，25 ℃时取值12.7；ΔHα 为活化能（KJ/mol），25 ℃时取值23.2；R 为摩尔气体常数（KJ/ （Kmol）），25 ℃时取值8.314[17]。TK为绝对温度（K）。

采用FvCB 模型计算棉花叶片光合速率[18]，光合速率的气孔限制（Is）、叶肉限制（Im）和生化特征限制（Ib）计算式为[9]：

式中：KC和KO分别为CO2和O2的米氏常数；Vcmax为最大羧化速率（mmol/（m2·s））；O 为氧气物质的量浓度（210 mmol/mol）。

用Photosynthesis 软件和光合助手[19]处理叶片光合数据以及响应曲线数据，利用Origin 2017 作图，SPSS 21 软件进行单因素方差分析，采用Duncan 多重比较检验差异显著性（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 水盐胁迫对棉花叶片气体交换参数的影响

表1 给出了不同处理棉花叶片的光合速率、气孔导度和叶肉导度。水盐胁迫降低了棉花的叶水势。T2和T3 处理的叶水势分别为-1.21 和-1.23 MPa，显著低于T1 处理的-0.81 MPa；T4 处理的叶水势降低最为明显，显著低于T1—T3 处理。干旱胁迫、盐分胁迫和水盐胁迫降低了棉花叶片的气孔导度和叶肉导度，均显著低于T1 处理。T1 处理的叶片光合速率为27.10 μmol/（m2·s），显著高于T2 和T3 处理，但T2 和T3处理的差异并不显著。与干旱胁迫和盐分胁迫处理相比，水盐胁迫（T4）显著降低了棉花叶片的光合速率。

表1 各处理棉花叶片气体交换参数 Table 1 Gas exchange parameters of cotton seedling leaves in different treatments

2.2 不同处理棉花叶片的气孔特征与色素量

表2 给出了不同处理棉花叶片的气孔特征。与T1 处理相比，水分胁迫对棉花叶片的气孔长度和宽度影响不显著，但却显著降低了气孔密度。T3 和T4处理显著降低了棉花叶片的气孔密度、气孔宽度和气孔长度，且2 个处理间差异显著。

表2 各处理棉花叶片的气孔特征 Table 2 Stomatal characteristics of cotton seedling leaves in different treatments

表3 各处理棉花叶片的色素量 Table 3 Pigment content of cotton seedling leaves in different treatments

表3 给出了不同处理对棉花叶片色素量的影响。与T1 处理相比，干旱胁迫（T2）、盐分胁迫（T3）和水盐胁迫（T4）均显著降低了棉花叶片的叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素量。T3 和T4 处理的叶片色素量均显著低于T2 处理，但T3 和T4 处理只在类胡萝卜素量存在显著差异。

2.3 不同处理棉花叶片的光合限制因素分析

光合限制因素分析可以量化影响光合过程的胁迫效应。表4 给出了不同处理棉花叶片光合的气孔（IS）、叶肉（Im）和生化特征（Ib）抑制因子。在无胁迫条件下（T1），棉花叶片的光合过程主要受限于生化特征因子。然而，水分胁迫和盐分胁迫增加了IS和Im值，表明胁迫条件下，CO2从大气进入细胞羧化位点的阻力在抑制棉花光合性能方面起着主要作用。T2 和T3 处理间的Ib、IS和Im值差异并不显著，T4处理的Ib和Im值与T2 和T3 处理的差异显著，但IS并不显著。

表4 各处理棉花叶片的光合限制因素 Table 4 Limiting factors of cotton leaf photosynthesis in different treatments

表5 各处理棉花叶片吸收光能的消散比例 Table 5 Percentage of leaf absorbed light energy dissipation of cotton seedling in different treatments

2.4 不同处理对棉花叶片吸收光能分配的影响

利用ΦPSII、ΦNPQ和Φf,D指标分析PSII 天线吸收的光子分配到光合电子传递和热耗散。表5 给出不同处理棉花叶片吸收的光能通过ΦPSII、ΦNPQ和Φf,D消散的比例。在100、500 和1 200 μmol/（m2·s）3 种不同光照条件下，4 个处理的Φf,D值相对稳定，约占总吸收能量的23%。低光强条件下，ΦNPQ值较低，随光强的增加ΦNPQ值增加；1 200 μmol/（m2·s）下的ΦNPQ平均值为0.645，表明胁迫条件下热耗散是消除过剩光能的主要途径。与ΦNPQ不同的是，ΦPSII随光强的增加而逐渐降低；在高光强条件下，消除的光能低于20%。结果表明，在胁迫条件下棉花主要通过热耗散来消除过剩的光能。

3 讨 论

气孔是植物叶片与外界气体交换和水分散失的主要通道，也是影响植物光合蒸腾过程的主要因素之一。植物能够根据环境因子的变化而调节气孔分布、气孔密度及气孔大小，使植物在损失水分较少的条件下获取最多的CO2。在本研究的水分和盐分胁迫条件下，棉花叶片的气孔开度和密度降低、气孔导度下降，导致进入叶片的CO2质量浓度降低，进而降低叶片光合速率，这与已有研究结果相一致[20-22]。本研究中的水分胁迫为中度胁迫，150 mmol/L 盐分胁迫对于棉花幼苗是较高的盐分胁迫，也是常用的棉花盐分胁迫水平[12]。Flexas 等[23]与Cano 等[24]认为干旱胁迫下植物叶片叶绿体内的CO2质量浓度降低是光合速率降低的主要因素；江晓慧等[12]发现盐胁迫使叶片气孔下腔到叶绿体羧化点CO2的路径受损，CO2传输效率降低。上述研究均表明胁迫条件下植物叶片的叶肉导度降低、阻力增加，光合速率受叶肉因素限制而降低。本研究发现水盐胁迫T4 处理的气孔开度和密度均显著低于T2 和T3 处理，而且T4 处理的气孔导度和叶肉导度也显著低于T2 和T3 处理，表明水盐胁迫植株叶片光合速率的非气孔限制贡献要高于T2 和T3 处理。

水分胁迫[25-26]和盐分胁迫[27-28]都可显著抑制光合色素的合成，进而降低了水分和盐分胁迫对植株的伤害。本试验的T2 和T3 处理的棉花叶片色素量均显著低于T1 处理，而水盐胁迫T4 处理的色素量又较T2 和T3 处理显著降低。水盐胁迫降低叶片色素量的原因可能是色素合成受阻以及胁迫增强叶绿素酶活性、加速了叶绿素分解；而类胡萝卜素的降低可能是由于胁迫所产生的活性氧破坏了色素分子所致[28-29]。尹海龙等[28]发现盐胁迫下叶绿素下降的主要原因是叶绿素a 量降低，而本研究中T3—T4 处理棉花叶片的叶绿素a 和叶绿素b 量均较T1 处理显著降低，供试植物与盐分质量浓度的不同可能是导致研究结论不一致的主要原因。

植物光合碳同化能力下降的主要因素包括气孔限制和非气孔限制，而植物光合是受气孔限制还是非气孔限制，取决于植物自身和生境条件[30-31]。但植物光合过程是受气孔限制还是非气孔限制，尚无一致的结论。本研究中，T2—T4 处理的IS（平均值为38%）较T1 处理（18%）约增加了1.1 倍，表明胁迫条件下气孔限制对棉花叶片光合速率降低的贡献约占38%，而非气孔限制的贡献占了62%。在非气孔限制因素中，胁迫处理的Ib降低了45%，但Im增加了40%，表明叶肉导度降低引起的CO2传输阻力增加是棉花叶片光合速率降低的主要非气孔因素。T2—T4 处理的IS和Im值相差不大，平均值分别为0.38 和0.35，表明胁迫降低棉花叶片光合速率主要是由于气孔导度和叶肉导度的降低。Wang 等[32]也认为气孔导度和叶肉导度降低是干旱胁迫降低叶片光合速率的主要因素，这与本研究的结论相一致。

本研究发现受水盐胁迫的棉花主要通过基础过程（热和荧光耗散）来耗散过剩的能量，这与Riva-Roveda 等[34]的研究结果相一致。1 200 μmol/（m2·s）下棉花叶片的ΦNPQ平均值为0.645，较高的ΦNPQ说明光合机构吸收的光能更多的是处于过剩状态，但植株仍可通过调节热耗散机制来消除过剩能量带来的危害。

4 结 论

1）150 mmol/L 的盐分处理和水盐处理（150 mmol/L 盐分与中度水分胁迫）显著降低了棉花叶片的气孔密度、气孔宽度和气孔长度，显著降低了棉花叶片的叶绿素a、叶绿素b 和类胡萝卜素量。

2）胁迫条件下，气孔导度和叶肉导度降低在抑制棉花光合性能方面起着主要作用。当叶片光合性能受到抑制时，植株主要通过热耗散途径来消除过剩能量。