蒲公英和鱼腥草粗多糖对小鼠DSS诱导性肠炎的功能恢复研究

王帅珂 吕英杰 张月鹏 丁 壮 韩 军 郭尚敬 陈 芳

(1.聊城大学 药学院，山东 聊城 252059； 2.聊城大学 生物制药研究院，山东 聊城 252059；3.聊城大学 农学院，山东 聊城 252059)

蒲公英(Taraxacumofficinale)属菊科，多年生草本植物，广泛分布于北半球，作为中国传统中药材之一在治疗疾病方面已有上千年历史[1,2]，并且蒲公英能够发挥不同的药理作用，如抗癌、抗风湿、清热解毒、抗菌、抗糖尿病以及抗炎特性等[3-5].现代研究表明，原始蒲公英的治疗效果要归因于生物活性成分，包括多糖类、生育酚类、肉桂酸衍生物、黄酮类、三萜类化合物和维生素B2等[6-8].在上述物质中，多糖已被证明是具有多种药理学功能的主要活性成分之一，例如从普通的蒲公英地上部分分离出的多糖具有保护肝脏的作用[9].从蒲公英根部提取的多糖能够抑制对乙酰氨基酚(APAP)所诱导的肝脏氧化损伤[10].此外，从蒲公英叶子中提取的多糖作为抗炎和抗氧化剂能够发挥有效的药理作用[11].

鱼腥草(Houttuyniacordata)属三白草科，主要产于云贵川以及南方地域.味辛，性微寒，具有清热解毒、利尿通淋、抗病毒等作用[12].鱼腥草的抗病毒[13]、抗炎[14]、抗菌[15]、抗增殖活性[16]已被许多研究证实.鱼腥草作为一种传统治疗肺炎的中草药，其主要活性成分为多糖类物质[17].从鱼腥草全草中提取的鱼腥草多糖可以减轻急性肺炎损伤并且能够通过抑制TLR4通路和促炎细胞因子的表达，改善H1N1感染引起的肺部炎症[18-21].

现有的文献报道中，对蒲公英和鱼腥草多糖类物质的研究多为体外抗炎、细胞抗病毒以及多糖提取工艺等研究，鲜见多糖类物质对动物肠炎恢复及对肝肾功能影响的报道.因此本研究探索了蒲公英和鱼腥草粗多糖对小鼠肠炎及肝肾功能的影响，分别对两种不同的革兰氏阳性菌和阴性菌做了体外抑菌实验；并通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠肠炎，分别观察并分析两种粗多糖对小鼠肠炎的恢复效果，以及反映肝肾代谢功能的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(Cr)和尿素氮(Bun)的酶活性变化，阐明蒲公英和鱼腥草两种粗多糖对肠炎恢复及肝肾保护功能，为今后蒲公英和鱼腥草多糖的临床应用提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 实验材料

蒲公英提取物10∶1(西安瑞林生物科技有限公司)、鱼腥草提取物10∶1(西安瑞林生物科技有限公司)、蒲公英和鱼腥草粗多糖溶液.

实验菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CMCC 63051)，大肠杆菌(Escherichia coliCMCC 44102)，铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaCMCC10104)，金黄葡萄球菌(StaphylococcusauresCMCC26003)

1.2 主要试剂与仪器

苯酚AR(烟台远东精细化工有限公司)；硫酸AR(烟台远东精细化工有限公司)；氯仿AR(天津致远化学试剂有限公司)；正丁醇AR(天津致远化学试剂有限公司)；丙酮AR(天津致远化学试剂有限公司)；葡萄糖AR(天津大茂化学试剂有限公司)；纤维素酶10000 U/g(南宁东恒华道生物科技有限公司)；氨苄青霉素(Amp)、葡聚糖硫酸铵盐(dextran sulfate sodium，DSS，都莱生物科技有有限公司，MW：40000，Assay：≥98.0%)，肝肾酶活测定试剂盒(南京建成生物科技有限公司)、超净工作台、恒温培养箱、离心机(eppendorf)、灌胃针、酶标仪(BIOTEK)、旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)；净水系统Milli-Q Advantage S.Kit(USA)；超低温冰箱MDF U53V(日本三洋).

1.3 实验方法

1.3.1 粗多糖制备方法. (1) 样品液的制备，分别称取5 g蒲公英和鱼腥草提取物粉末，按照1∶20的料液比加入去离子水100 mL，调节pH至5.0±0.05，再加入10000 U/g的纤维素酶，使浓度含量控制在3%，然后将混合物置于超声水浴槽中50 ℃超声处理40 min.旋蒸仪浓缩提取液，加入80%乙醇沉淀24 h.3000 rpm，5 min离心收集沉淀物，用无水乙醇和丙酮清洗2-3次，采用冷冻干燥的方法制备粗多糖.(2) 粗多糖脱蛋白处理，将以上步骤所获得的粗多糖溶解于去离子水中，用氯仿-正丁醇(4∶1)处理进行脱蛋白，重复4-5次；收集水相并浓缩至原体积的1/5，使用80%乙醇在4 ℃沉淀24 h.之后将上清液浓缩，透析48 h，祛除小分子物质，收集透析袋中物质冷冻干燥； (3) 粗多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量[22].首先制备5%的苯酚溶液，4 ℃冷藏备用；再配置葡萄糖标准液，准确称取10 mg葡萄糖，于250 mL容量瓶中定容，使其浓度为0.04 g/L,分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，加入到试管中，各自加入去离子水补至1.0 mL，在冰浴中先后加入5%苯酚0.5 mL和浓硫酸2.5 mL，摇匀冷却以不放热或微量放热为宜，沸水浴中加热20 min，凉水冷却10 min，0 mL做空白对照调零，490 nm下测定吸光度，以葡萄糖浓度(g/L)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制回归直线.

1.3.2 粗多糖抑菌实验方法. (1) 菌株活化方法：用接种环将保存好的细菌菌株接种于灭菌的LB液体培养基中，180 rpm，培养过夜.(2) 抑菌圈测定方法：制备1 mg/mL的氨苄青霉素100、50、25 g/L粗多糖溶液.采用滤纸片方法进行抑菌实验，将经过灭菌的LB固体培养基倒平板，静置待其凝固；凝固后吸取100 mL的菌液进行均匀涂布；每一处可以摞2-3层6 mm直径滤纸片；向滤纸片表面加入10 mL药液，阴性对照加入同样体积的去离子水，阳性对照则加入同等体积的羟氨苄青霉素， 37 ℃培养14-16 h观察结果.

1.3.3 DSS诱导小鼠肠炎模型建立方法. (1) 实验动物与分组：云南昆明鼠，雌性，48只，重量35 g，分为4组(空白对照组、自然恢复组、蒲公英组、鱼腥草组)，每组4只，3次重复.(2) 小鼠肠炎模型建立：精密称取0.5 g DSS，溶解到10 mL去离子水中，漩涡震荡使其完全溶解，制得5%含量的DSS溶液；在建模前12 h小鼠应当禁食不禁水，参考给药量为0.1-0.3 mL/10 g，最大不超过0.5 mL/10 g[23].连续7 d灌胃处理，每天灌胃1次，剂量为350 mL ；空白对照组灌胃相同体积的生理盐水.DSS处理7 d后进行粗多糖处理21 d，空白对照组灌胃等体积的生理盐水.(3) 生理生化指标测定：小鼠DSS处理后每天观察记录排便情况、粪便状态、肛周污染情况、体毛发光泽变化等情况，每3天测量1次体重；

DSS处理后每7 d取血液样品一次，取血方式采用眼球取血；血样3500 rpm，离心10 min，分离上清即实验所需要的血清样品；-80 ℃超低温冰箱贮存.根据试剂盒(南京建成生物科技有限公司)的使用要求检测血清中肝肾代谢相关酶AST、ALT、Cr和Bun的水平.

2 结果与分析

2.1 多糖含量的测定

表1 葡萄糖标准液的制备

图1 葡萄糖标准溶液不同体积吸光度

表2回归方程参数

回归方程参数数值R20.995方程Y=0.032X+0.063

图2 蒲公英和鱼腥草多糖冻干粉

将得的粗多糖称取0.015 g溶解到30 mL去离子水中，配制成0.5 μg/L母液，按照表1的操作方法，测量其吸光度并代入到对应的回归方程(图1、表2)，算得每mL蒲公英粗多糖含糖量为76.1% ；鱼腥草粗多糖含糖量为每mL粗多糖含糖量为73%，采用冷冻干燥法获得粗多糖样品(图2).

2.2 体外抑菌效果分析

注：图中A平板为蒲公英粗多糖处理，B平板为鱼腥草多糖处理；图中1为5 μg氨苄青霉素；2为500 μg粗

多糖；3为无菌水对照；4为250 μg粗多糖；5为125 μg粗多糖.

图3蒲公英和鱼腥草粗多糖体外抑菌效果

从图3可知，三种不同浓度蒲公英粗多糖溶液对大肠杆菌均未有抑菌效果，而100 g/L和50 g/L的鱼腥草粗多糖溶液对大肠杆菌有一定的抑菌效果，如图3(1)；蒲公英粗多糖和鱼腥草粗多糖溶液对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果，并且与1 g/L的Amp的抑菌效果相当，如图3(2)；两种粗多糖溶液对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均未有明显抑菌作用，只有100 g/L的鱼腥草粗多糖溶液对金黄色葡萄球菌有较小的透明圈，如图3(3)、(4).

2.3 小鼠相关指标观察和测定

表3 小鼠相关指标观察和测定

由表3可知，建模完成一周后，自然恢复组、鱼腥草组、蒲公英组的小鼠均出现腹泻、肛周肿胀发红、精神状态欠佳、食欲下降，并且除空白对照组以外其它三组小鼠的粪便出现了量多、连结、粘稠、不定型等症状；经过药物处理第3 d和第4 d得到了较为明显的改善，但仍旧有轻度腹泻的症状，鱼腥草组小鼠鼻孔还伴有轻微的出血的现象，具体原因有待于进一步实验分析探讨.

2.4 小鼠肝肾功能指标分析

由图4可知，实验周期内经过DSS处理的自然恢复组AST酶活力值最高，空白对照组最低，蒲公英组和鱼腥草组介于两者之间.DSS处理第7 d AST 酶活力值与空白对照相比显著升高，说明DSS处理引起小鼠肝毒性使得AST酶活力值升高.DSS处理7 d后进行蒲公英和鱼腥草粗多糖灌胃处理3 w，经蒲公英和鱼腥草粗多糖处理7 d后，AST酶活力值与自然恢复组相比即出现显著下降，粗多糖处理3 w后酶活力值逐渐降低并趋于正常值，因此蒲公英和鱼腥草粗多糖处理显著降低了AST酶活力，减轻了由DSS引起的小鼠肝毒性.

图4 小鼠AST酶活力值

图5 小鼠ALT酶活力值

经过DSS处理的小鼠，自然恢复组小鼠的ALT值也是最高的，空白对照组最低，蒲公英组和鱼腥草组介于两者之间(图5).DSS处理第7 d，自然恢复组ALT酶活力值与空白组相比显著升高；经粗多糖处理21 d后蒲公英组和鱼腥草组小鼠ALT水平几乎无差异，并且下降至空白组水平范围；自然恢复组在DSS处理第21 d后ALT也出现了下降，但其水平仍明显高于其它三组小鼠ALT水平.因此两种粗多糖处理显著降低ALT酶活力，降低了由DSS引起的小鼠肝毒性.

由图6可知，经过DSS处理，自然恢复组酶活力值上升最明显并且酶活力值最高；随后酶活力开始下降；鱼腥草组始终处于下降状态，并且趋势很稳定，第7-28 d酶活力值变化不显著，鱼腥草组经过粗多糖处理，其酶活力值在第14 d以后就低于空白组，考虑为鱼腥草在改善Bun指标的效果上要优于蒲公英；蒲公英组酶活力值在第21 d和第28 d时下降到与空白对照组相当水平.因此，两种粗多糖可以有效降低Bun酶活力值并且对DSS小鼠的肾脏具有保护作用.

由图7可知，模型组的酶活力值都明显高于空白对照组；在模型组中，自然恢复组的酶活力值又高于蒲公英组和鱼腥草组；鱼腥草组和蒲公英组自DSS处理后第8 d开始，酶活力值一直处于下降状态，蒲公英组酶活力值一直低于鱼腥草组，自然恢复组从第21 d起，酶活力值也开始下降，但是仍旧高于其它三组值.因此，两种粗多糖在降低Cr酶活力值方面起到了重要作用并且也能够保护小鼠肾脏，降低由DSS引起的肾功能损伤.

图6 小鼠Bun酶活力值

图7 小鼠肌酐(Cr)酶活力值

3 结论

本研究采用超声波-酶辅助方法对蒲公英和鱼腥草进行粗多糖的提取，提取率达5.22%-5.78%；采用酶标仪检测法，测出粗多糖含糖率达到了73%-76.1%；在此条件下又对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行了抑菌实验，所得到的效果为鱼腥草粗多糖的抑菌效果要优于蒲公英多糖，并且100 g/L的蒲公英粗多糖和鱼腥草粗多糖与1 g/L的Amp的抑菌效果相当，在这四种菌中，枯草芽孢杆菌对粗多糖的敏感性最高，铜绿假单胞菌最不敏感.动物实验中，两种粗多糖均能改善小鼠因DSS诱导肠炎而产生的体态不良反应，并且也能够从一定程度上缓解因DSS造成的肝肾功能损伤；同时也为实验下一步探究粗多糖对小鼠抗炎机制奠定了良好的基础.