溶藻菌固定技术在除藻中的应用研究进展

魏志莹，叶愉群，杨秀雯，宋金诺，陈立斌

(长江大学 资源与环境学院，湖北 武汉 430100)

1 引言

近年来，随着工业技术的迅速发展和人口的快速增长，人类向水体中排放大量含氮和磷的有机物[1]，使得我国大部分的河流和湖泊出现水体富营养化现象。特别在夏季藻类繁殖迅速导致水体缺氧、发臭、鱼类大量死亡等现象，严重威胁到生态系统健康[2]。有些藻类的分泌物会导致饮用水中带有异味，通常是土霉味、鱼腥味等[3]。高欣等[4]研究结果表明全球气候变化将有可能造成铜绿微囊藻水华的生物量增加，总微囊藻产毒量也将随之增加。据流行病学调查显示，饮用水源中微囊藻毒素是中国南方一些地区原发性肝癌发病率高的主要原因之一[5]，微囊藻毒素污染还可造成野生动物、家畜、家禽等中毒死亡[6]。因此如何有效地预防和治理藻类在水体中的过度繁殖,是目前迫切需要解决的关键科学问题。

目前，国内外主要的除藻方法为化学法、物理法和生物法[7]。化学法虽然简便易行、省时省力，但该方法并不能从根本上改善水质，还会对环境造成二次污染，从而使水质环境形成严重的恶性循环[8]；物理法成本高，不能从根本上解决营养成分对藻类的刺激作用[10]；生物法充分利用了生态系统中各生物的相互作用，可以有效地控制藻类生长，而不会有其他任何负作用存在[9]。在生物除藻法中，溶藻菌除藻具有环境友好，二次污染较低等特点[11～15]，但是自然因素对溶藻菌在实际应用过程中存在一定的影响[16]，如自然水体流动对溶藻菌浓度有一定的稀释作用，会降低溶藻菌在水体中的除藻效率，而且，当溶藻菌浓度降低到一定阈值，将不存在溶藻现象[17]。如今可以通过固定溶藻菌除藻技术提高除藻的效率，将溶藻菌固定于载体上能缓解水流对溶藻菌的稀释作用；而且固定溶藻菌也可以确保溶藻菌的稳定生长；此外，固定于载体上的溶藻菌还可以重复利用、多次除藻[18]。因此，溶藻菌固定技术是溶藻菌除藻方面迫切需要的关键技术。

本文对国内外的固定溶藻菌除藻技术进行评述，以利于促进溶藻菌除藻方法的完善。

2 溶藻细菌的类型及作用机理

2.1 溶藻细菌的类型

溶藻细菌(algicidal bacteria)是一类以直接或间接方式抑制藻类生长，或杀死藻类细菌的统称。细菌在水生生态系统中起着重要作用，与藻类生物量平衡有很大联系[19]。有相关研究表明水华和赤潮的突然消亡可能与溶藻微生物的感染有关[20～23]，面对水华问题,在物理、化学和其他生物方法除藻技术仍存在诸多局限，目前报道的溶藻微生物大多从自发生水华或赤潮的海洋或湖泊中分离[24]。现今，溶藻细菌已经成为微生物控藻研究的热点。

目前报道的溶藻细菌主要归属于以下类群[12]:变形菌门 ( Proteobacteria)γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)和交替单胞菌属 (Alteromonas)，拟杆菌门(Bacteroidetes)的噬纤维菌属( Cytophaga)、腐螺旋菌属(Saprospira)、黄杆菌属( Flavobacterium)、γ-变形菌纲的弧菌属(Vibrio)和希万氏菌属(Shewanella)，革兰氏阳性菌厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)的芽孢杆菌属(Bacillus)和Planomicrobium属，放线菌门(Actinobacteria)放线菌纲(Actinobacteria)的微球菌属 (Micrococcus)。以上菌属多为革兰氏阴性菌，靶藻范围涉及蓝藻、绿藻、硅藻及甲藻等。通过前人文献的研究还发现，随着种群的发展，菌株分泌物可能通过降解光合色素，破坏藻细胞内的pH梯度来阻断光合作用，致光合电子产量下降[25]，从而阻碍藻细胞细胞壁合成，抑制孢子形成[26]，并且随着菌株分泌物的增加，也会影响藻细胞正常生长，从而可以达到细菌对藻华的控制作用。目前，章登岚等[27]研究发现假单胞菌是较容易筛选得到的溶藻细菌。

2.2 溶藻细菌的作用机理

溶藻细菌的作用机理一般可以分为两部分：直接接触溶藻和间接接触溶藻。直接接触溶藻是细菌通过与藻类细胞直接接触从而产生的一种作用，而间接接触溶藻是释放特异性或者非特异性的胞外物质抑制或者溶解藻细胞[28]。

直接接触溶藻，在整个溶藻的过程中，溶藻菌通过直接作用于藻类，与藻细胞直接接触，有的溶藻菌会直接侵入藻细胞使得藻细胞溶解。Furusawa等[11]研究出的一株腐生螺旋体属海洋细菌，能够杀死并且裂解角毛藻和硅藻细胞。粘细菌也是可以直接接触溶解蓝藻细胞的细菌[29]。短小的芽孢杆菌(DC-L5)可以溶解绿色的微囊藻，惠氏微囊藻、水华鱼腥藻和水华束丝藻[30]。气单胞菌属(Aeromonas)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)和微球菌属(Micrococcus Cohn)在处于对数期时溶藻能力最强[31]。

间接接触溶藻，溶藻菌通过与藻类产生营养物质的竞争，或者溶藻菌分泌某一种胞外产物从而抑制藻类的生长或溶解藻细胞。前人研究发现铜绿假单胞菌能够释放一种耐热性的小分子物质，对实验的绿藻和蓝藻的生长有强烈抑制作用[32]。柄细菌属能分离一种抗生素，这种物质对中骨条藻和赤潮的异湾藻产生抑制作用[33]。革兰氏阳性菌通过分泌具有溶藻特性的胞外活性物质间接溶藻。该活性物质会使藻细胞周期被阻滞到DNA复制前期，从而导致藻细胞不能正常进行DNA复制及分裂；并且还会对藻细胞产生氧化损伤,破坏藻细胞抗氧化酶系统；此外还能降低藻细胞光合电子传递效率，进而影响其正常的光合作用，从而降低藻细胞生物量[34]。

然而现今，仅通过溶藻菌直接对藻类处理，效率并不高。前人研究表明[35]，可以利用驯化的污泥，经过海绵固定化，从而构建一种对藻类、藻毒素等物质去除率高的微生物处理系统。海绵固定化微生物处理系统中，微生物主要是细菌、原生动物纤毛虫、肉足虫以及后生动物轮虫。当运用常规的活性污泥法，对活性污泥进行为期7 d及以上的驯化，利用海绵对其进行固定，当反应器水力停留时间为5h时，微生物处理系统对于藻类物质的去除率可高达90%。这种对于水体中的藻类以及藻类在水体中分泌的藻毒素有着良好去除效果的固定化微生物系统，在分离溶藻细菌时，所用的实验时间相对较短，效率相对较高，针对性相对较强，并且避免目前溶藻细菌均分离自天然水体、水样的浓缩量较大且耗时等系列缺陷。并且刘晶等[17]发现细菌溶藻需要一定的初始浓度,才可获得理想的溶藻效果,当低于溶藻细菌菌液浓度下限,溶藻现象延迟或不明显。而且，在实际应用中，溶藻菌浓度会受到河水流速的影响，溶藻菌浓度降低，导致除藻效率减弱。

3 溶藻细菌固定化技术

微生物固定化是利用物理或化学法将游离或分散的微生物限制在特定区域内，促使微生物浓度提高，并保持其生物活性且能循环再生的方法[36]。固定化技术与传统的悬浮生物相比有着处理效果高、速度快，稳定性强，产污泥量少，固液分离效果好等优点[37]，在溶藻方面比较有效且可行。

固定溶藻菌除藻可以提高溶藻菌对藻类的生物降解作用。于光等[18]通过研究发现，聚己内酯纳米纤维膜(NMP)固定化溶藻菌可以显著提高溶藻菌对铜绿微囊藻和微囊藻毒素LR(MC-LR)的生物降解作用，且在NMP上添加适量的溶藻菌营养物后，不仅可以提高溶藻率，还可以增加固定化溶藻菌的重复利用次数。

固定化细胞技术能够为溶藻菌提供生长繁殖的基质，确保溶藻细菌的稳定生长。刘萍等[38]模拟动态生物膜反应器(dynamic membrane bioreactor，DMBR)反应器，利用反应器的过滤系统，菌体在膜组件上自生成膜并稳定增长，对水体中N、P、叶绿素a等有明显的去除效果，还改善了水质。

固定化技术将溶藻细菌控制在载体上，还为溶藻细菌的生长繁殖提供支持与保护[38]，并增加了溶藻菌的作用效果。Jung S W[16]等人研究一种荧光假单胞菌HYK0210-SK09除藻效果发现，藻细胞被溶解需要5×106cell/mL的阈值细胞密度，当SK09细胞在自然环境中扩散并低于此密度时，对藻华不再有控制作用。

Kang等[39]采用纤维素海绵对溶藻细菌荧光假单细胞(Pseudomonas fluorescens)进行了固定化处理，分析了固定化溶藻菌与悬浮细菌两种方法处藻的效果，得出与悬浮细胞除藻相比，固定化溶藻菌除藻能够有效降低冠盘藻(Stephanodiscus sp.)藻密度，还能明显去除硝态氮及可溶性磷等物质。

因此，在实际除藻应用中，采用固定化溶藻菌除藻不仅能有效提高溶藻菌除藻效率，还能为溶藻细菌的生长繁殖提供支持与保护，确保溶藻细菌的稳定生长，而且还能增大对其它污染物的去除率。

3.1 固定化载体种类

固定载体材料可以分为无机载体、有机载体和生物载体[40]。无机材料主要包括：沸石、硅藻土、活性炭、玻璃等，无机载体一般对生物无毒，传质性能良好，成形方便且固定密度高等优点，但在厌氧条件下易被微生物降解。肖尧[41]等研究中发现用硅藻土固定细菌T1，并辅助曝气系统，对水体以及底泥中氨氮有较好的去除效果。陈爽[42]等利用新型粉煤灰陶粒固定有效微生物群落时发现其对模拟水产养殖污水中氨氮、总氮、总磷的最大去除率可分别达99.14%、92.18%、44.35%。李云晖[43]等利用从太湖提取用氧化铁纳米材料固定的芽孢杆菌去除铜绿微囊藻发现溶藻率达53%，并且对微囊藻毒素降解率达到了33%对比未用氧化亚铁颗粒固的芽孢杆菌作用铜绿微囊藻去除率44.3%和微囊藻毒素降解率20.5%。

有机载体包括一些天然的聚合物衍生物：海藻多糖(海藻酸盐、卡拉胶、琼脂、琼脂糖)与一些人工合成的聚合物：丙烯酰胺、聚氨酯、聚乙烯醇、树脂，以及从甲壳素中提取的氨基多糖壳聚糖已被用于实验中[44]，有机合成材料有着抗微生物分解性能好，机械强度高等优点，但聚合物网络的形成条件较剧烈，对微生物细胞损害较大[40]。

Luz E.de-Bashan等[45]用海藻酸钠固定小球藻和索氏囊藻两种微生物，固定后对废水处理效果优于单独使用的处理效果，其中，固定后对废水中氨氮的去除达100%，对硝酸盐去除率达15%和对磷的去除率达36%对比于未固定对氨氮的去除率为75%，硝酸盐6%，磷19%。Zhang[46]等利用聚乙烯醇(PVA)凝胶固定活性污泥，经活化后，活性污泥自养菌和异养菌生物稳定性和生物活性均有较大提高。

生物材料是以活性污泥为载体，利用凝胶剂将微生物与活性污泥凝聚，利用交联剂交联，制成微生物复合体，微生物以活性污泥为载体，可为吸附的溶藻菌提供生长基质[47]。

3.2 固定化方法

目前微生物的固定法主要有包埋法、吸附法、交联法、系统截留法等符合固定化的方法[48]。也可分为6种固定化类型：共价偶联、亲和固定化、吸附、液-液乳化液中的限制、半透膜后的捕获和包封。但这些方法分组并非绝对，因为在某些特定情况下，很难将某个方法划分为某个特定的组别[49]。

包埋法是通过聚合作用、沉淀方式等将微生物与载体结合，制备成具有一定机械强度的小球，微生物位于载体材料的内部。包埋法操作简单，对微生物稳定性较强、活性影响小[50]。Xin[51]等利用两株菌株(JB1和JB2)对底泥中的苯并[a]芘进行降解，最终发现经固定化细胞降解率达71.9%，远高于游离细胞的47.7%。汤瑶[52]发现固定化复合菌和液态游离菌在的处理黑臭水体效果出现比较明显的差异，是由于固定化复合菌载体的载体材料以及包埋添加的生物促生剂对固定化复合菌的生长速率、活性和稳定性有显著的加强。

吸附法利用固定化载体的物理性质或与微生物之间的作用力将其吸附在载体上，以达到微生物固定化的目的。根据吸附原理可分为物理吸附、共价吸附、离子吸附[53]。张秀霞等[54]采用吸附法制备固定化微生物，发现固化微生物对原油的降解性可以通过表面吸附来实现对菌的固定,并且发现原油降解之后的材料结构会变疏松,菌也易脱落，对实验的最后效率会比未固定时效率高。乔鑫[55]分别筛选鉴定了一株异养硝化细菌和一株好氧反硝化细菌分别采用吸附法和包埋法制备微生物固定化体,进行微生物固定化对氨态氮及硝态氮的去除动力学，发现吸附法制得微生物固定化体对氨态氮的去除效果优于包埋法，去除效率更高。郭吉[56]以聚乙内酯作为人工介质进行挂膜，富集溶藻细菌，发现经过36h后固定效果最佳并有较好的溶藻效果，并且适当增加营养物质能使固定化溶藻细菌重复利用率增加，溶藻活性相对增强。

交联法是不利用载体直接依靠物理或化学作用使细胞相互结合，又可根据细胞结合方式分为化学交联法和物理交联法[57]。化学交联剂是通过交联剂使交联剂上的官能团与微生物菌体表面电荷或位点形成网状结构实现微生物的固定。物理交联法是微生物培养过程中适当改变活性污泥的培养条件来使微生物细胞间直接吸附络合作用，物理交联法机械性较差，化学交联法中化学试剂的毒性对细胞可能会有毒害作用，因此不适宜固定活细胞[58]。牛志卿等[59]采用聚集-交联法固定化紫色非硫光合细菌用于处理活性艳红X-3B染液，比较游离微生物和固定化微生物的某些性质时，发现固定化微生物的反应适宜pH值范围较宽。比较所得固定化微生物和由海藻酸钠包埋固定化微生物的脱色能力时，前者的脱色活力较高、成本低，易于工业化应用。刘巍等[60]利用PVA-Ca(NO3)2-冻融法、PVA-硼酸法、PVA-磷酸盐法这三种物理交联法固定化降解苯胺的混合菌种GA1，结果表明，PVA-Ca(NO3)2-冻融法膨胀系数更低，具有最好的强度和稳定性，对高浓度苯胺溶液有优异的降解效果。王杏佳等[61]通过实验得出采用CaCl2做交联剂制备的聚乙烯醇(PVA)固定化凝胶小球有利于固定化微生物的附着生长，将其用于水处理实验，其15 h时氨氮去除率可达90%。

系统截留法是利用半透膜(如渗析膜、超滤膜、反渗透膜、中空纤维膜等)将酶、微生物或动植物细胞限制在一定的空间范围内，微生物细胞不能透过此网状结构，但底物和产物可以通过[62]。系统截留法中孔网状载体有着对微生物的截留与保护作用，有利于难降解有毒物质的处理，并且可以承受冲击负荷，对污染物的去除效率高，还可以去除细菌病毒；但是其载体介质易受到污染和堵塞，还需要控制微生物细胞的过度生长，否则会因局部扩散阻力过大，对载体介质结构造成破坏[63]。

3.3 固定化技术的不足

传统生物处理藻类由于成本花费高，处理效率低[64]，难以满足我国工业社会的发展，而今溶藻菌固定技术已经在处理藻类方面有着良好的效果而且有广阔的应用前景[65]，但是多数研究仅限于实验室阶段，要使其实际应用到现实生活中对藻类的处理还有很多工作要做[66]。

(1) 溶藻菌固定化技术不够成熟，固定化材料不够理想，由于固定化载体颗粒在空间分布不均匀，导致传导性能有所差异，造成溶藻菌对养分的吸收，代谢废物的排放受到阻碍作用，降低了除藻效率。

(2)现今对固定化溶藻菌生长代谢的动力学研究参数较少，很难为大量工业化制备设施提供理论依据[67]。

4 展望

(1)在固定化载体方面进行创新。提高载体稳定性，延长载体寿命，开发低成本、环保型载体材料，为固定溶藻菌除藻技术提供载体准备；同时提高固定化载体的重复使用率，降低使用成本；而且需要对固定化溶藻菌的颗粒相对密度进行适当的改进和调整。

(2)改进固定化方法。开发新型固定化技术或者复合现有固定化技术，以减少固定对溶藻菌活性的影响，以达到最佳除藻效果。

(3)加大力度开发固定化溶藻菌工业化制备设施，以实现固定化溶藻菌在工程上的应用。