消肿散外敷与冰敷对骨骼肌损伤模型大鼠中MDA含量和LDH活性的影响

王强 胡劲松 李飞跃

摘要 目的：探讨消肿散外敷与冰敷对骨骼肌损伤模型大鼠中MDA含量和LDH活性的影响。方法：采用打击造模的方法，将86只SD大鼠造成急性软组织损伤模型。造模后将动物分为模型组20只、消肿散组20只、冰敷组20只、联合组20只、本底组6只。观察治疗后1 d，3 d，7 d，14 d MDA含量、LDH活性变化情况。结果：1）造模1 d后，MDA含量差异有统计学意义（P<0.05），进一步进行q检验两两比较，冰敷消肿散联合组的MDA含量低于损伤模型组（P<0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消肿散组、冰敷消肿散联合组的MDA含量均低于损伤模型组（P<0.05）。2）造模3 d后，冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。造模7 d后，消肿散组、冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。造模14 d后，消肿散组、冰敷组和冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。结论：消肿散和冰敷消肿散联合运用均能使损伤的软组织中MDA含量减少和LDH活性降低，对骨骼肌损伤有一定抑制作用，能改善肌肉组织形态修复程度。

关键词 冰敷;消肿散;骨骼肌;损伤;丙二醛;乳酸脱氢酶

Abstract Objective：To investigate the effect of Xiaozhong Powder and ice compress detumescence on MDA content and LDH activity in the model rats with injured skeletal muscle.Methods：By using the method of blow-up modeling，a total of 86 SD rats were made into acute soft tissue injury models.After modeling，the animals were divided into a model group of 20 animals，a Xiaozhong Powder group of 20 animals，a ice compress group of 20 animals，a combined group of 20 animals，and a background group of 6 animals.The changes of MDA content and LDH activity 1 d，3 d，7 d，14 d after treatment were observed.Results：1）After 1 day of model making，there was a statistically significant difference in MDA content，which was further compared by q test.The content of MDA in the combined ice compress Xiaozhong Powder group was lower than that of the injury model group（P<0.05）.After 3，7 and 14 days，MDA content in the Xiaozhong Powder group and the ice compress detumescence combined group was lower than that in the model group.After 3 days modeling，the LDH activity of the Xiaozhong Powder group and ice compress detumescence combined group were lower than the model group.After 7 days modeling，LDH activity in the Xiaozhong Powder group and the ice compress detumescence combined group was lower than that in the model group.After 14 days modeling，LDH activity of the Xiaozhong Powder group，the ice compress detumescence group and the combined group was lower than the model group（P<0.05）.Conclusion：Xiaozhong Powder and ice compress detumescence powder can reduce MDA content and LDH activity in injured soft tissues，inhibit skeletal muscle injury to a certain extent，and improve the repair degree of muscle tissue morphology.

Keywords Ice compress; XiaozhongPowder; Skeletal muscle; Injury; MDA; LDH

中圖分类号：R274.3 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.006

骨骼肌损伤是临床最为常见的软组织损伤疾病，是常见病多发病。其中以急性损伤为多，现代医学在治疗上采用传统的制动、冰敷及配合消肿药物，其中冰敷的治疗方法已是公认的行之有效的方法。而中医多以早期外敷清热消肿、活血化瘀止痛中药加局部制动治疗，临床症状改善亦效如桴鼓。“消肿散”，又名“三圣散”，是瑞金医院魏氏伤科名方，其全方药物组成少，效宏力专，已具有40余年的临床应用经验，具有良好的清热消肿、活血止痛作用和疗效[1-2]。本研究通过观察冰敷和消肿散对急性软组织损伤模型大鼠的干预，测定其血清MDA丙二醛（Maleic Dialdehyde，MDA）含量和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）的活性，以及对肌肉组织形态学的观察，来探讨冰敷和消肿散对大鼠骨骼肌的抑制肌肉损伤的作用以及改善矫揉做作形态修复程度的情况，以期进一步了解冰敷加用消肿散是否有协同增效作用，同时通过探讨其作用机制为临床提供一定实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 委托上海中医药大学实验动物中心购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司清洁级SD健康大鼠86只，体质量每只200 g左右。实验动物饲养于上海中医药大学动物实验中心SPF级动物房，室内温度为恒温（20 ℃±2 ℃），给予标准光照自动光-暗控制（LD12：12，即07：00～19：00光照，19：00～07：00暗置），相对湿度60% ～65%，动物摄食饮水自由。实验动物中心许可证号：SYXK（沪）2013-0016。

1.1.2 药物 消肿散（落得打、芙蓉叶、赤小豆等），本院提供，4 ℃保存备用。

1.1.3 试剂与仪器 异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：分析纯AR80109218）;无核酸酶水（麦约尔公司，批号：150728）;Trizol裂解液（Invitrogen公司，美国，批号：cat#15596-026）;DEPC水（SIGMA公司，美国，批号：Cas1609-47-8）;丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A003-1）;乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（南京建成生物工程研究所有限公司，货号：A020-2）。

紫外分光光度计（Thermo公司，美国，型号：NanoDrop2000）;超净工作台（苏州净化公司，型号：sw-cj-2d）;水浴锅（上海诚献公司，型号：HWS-24）;超细匀浆机（上海标本模型厂，型号：FJ150）;固体木质圆柱体（自制，长20 cm，质量620 g）;Eppendorf管（AXYGEN公司，美国，批号：cat#MCT-150-C，cat#T-200-Y，cat#T-300，cat#T-1000-B）;臺式冷冻高速离心机（Sorvall公司，美国，型号：FrescoD-37520）;电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-S26）;酶标仪（Thermo公司，美国，型号：ELX800）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 除空白对照组外，大鼠腹腔3%戊巴比妥钠注射麻醉（30 mg/kg），以固体木质圆柱体从高处自由落下进行1次打击伤，致伤位置在右小腿内侧面（其为腓肠肌中段，打击面φ为1 cm，下落物体长度为20 cm，重量为620 g，从40 cm高处落下，重力6.08N，动能2.43J）。先将造模后的动物随机编成1—86号，再将1—86号实验用动物随机分为损伤模型组20只、消肿散组20只、冰敷组20只、冰敷消肿散联合组20只、本底对照组6只。

1.2.2 干预方法 空白对照组大鼠不作任何处理，自由活动并常规饲养。消肿散组：将涂抹有消肿散的绵纸敷到致伤处，以透气胶布包扎固定，隔天换1次膏药，分别干预1 d、3 d、7 d、14 d。冰敷组：对大鼠致伤处外敷冰袋并胶布固定，30 min/d，1次/d，分别干预1 d、3 d、7 d、14 d。联合组：先对大鼠致伤处进行冰敷30 min，然后再贴敷消肿散，隔天换1次膏药。每次换药前先对致伤处进行冰敷30 min，分别干预1 d、3 d、7 d、14 d。

分别于造模后5 min，1 d、3 d、7 d、14 d取材。造模后5 min为本底对照组，共6只大鼠取材。后4个时间点（1 d、3 d、7 d、14 d）每个时间点共20只大鼠取材（5只/组×4组）。取材部位为腓肠肌中段（致伤处）。样本处理方法描述欠清晰：处死大鼠取其腓肠肌中段、清洗，切割，研磨，匀浆，保存，待测。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 血清MDA的含量检测 漩涡混匀器混匀，试管口用保险薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95°C沸水浴40 min，取出后流水冷却，然后3 500～4 000 r/min，离心10 min，离心半径10 cm。取上清，置于分光光度计（532 nm）处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

1.2.3.2 血清LDH的活性检测 按照试剂盒说明书的标准操作规程，将待测液体混匀，室温放置5 min，波长450 nm，酶标仪测定吸光度。计算公式：血清中LDH活性（U/L）=（测定OD值-对照OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度（0.2 mmol/L）×1 000。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两两比较采用q检验，组间比较采用方差分析，以P<0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 血清MDA的含量检测结果 经过方差分析，各组之间造模1 d后，差异有统计学意义（P<0.05），进一步进行q检验两两比较，冰敷消肿散联合组的MDA含量低于损伤模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消肿散组、冰敷消肿散联合组的MDA含量均低于损伤模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 血清LDH的活性检测结果 经过方差分析，各组之间造模1 d后，差异有统计学意义（P<0.05），进一步进行q检验两两比较，各组大鼠的LDH活性差异无统计学意义（P>0.05）。造模3 d后，冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。造模7 d后，消肿散组、冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。造模14 d后，消肿散组、冰敷组和冰敷消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组（P<0.05）。见表2。

3 讨论

3.1 消肿散外敷与冰敷对骨骼肌损伤模型MDA含量的影响 MDA的含量反映了体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤程度[3]。MDA含量既可反映肌体内发生脂质过氧化的程度，也可反映生物膜的受损程度[4]。当剧烈运动时，体内的氧化与抗氧化作用将失衡并导致细胞损伤，MDA含量的多少也间接反映了组织的损伤程度[5-7]。

本研究显示造模第1天后冰敷及消肿散联合组的MDA含量低于损伤模型组，其他组与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。造模3 d、7 d及14 d后，消肿散组、冰敷及消肿散联合组的MDA含量均低于损伤模型组。其中冰敷组的MDA含量造模前后均不低于损伤模型组，差异无统计学意义（P>0.05）。

由此可知，消肿散、冰敷及消肿散联合应用可以使MDA的含量明显降低，冰敷组中MDA的含量无明显改变。损伤的骨骼肌内部的MDA的生成减少，清除增多，说明消肿散能在一定程度上改善机体骨骼肌氧自由基生成与清除之间的动态平衡，从而增强机体骨骼肌的抗氧化能力，减轻MDA引起的对骨骼肌损伤。

也就是说，消肿散组、冰敷及消肿散联合组能使骨骼肌的损伤程度降低，即有一定抑制损伤的作用。而冰敷组并没有抑制骨骼肌损伤的作用。同时，可以看出冰敷及消肿散联合运用，冰敷也没有抵消消肿散抑制损伤的作用。

3.2 消肿散外敷与冰敷对骨骼肌损伤模型LDH活性的影响 研究认为LDH活性的变化是肌肉损伤程度的重要指标，其活性可以也反映骨骼肌的损伤程度[4，8]。

本研究显示，造模1 d后各组大鼠的LDH活性差异无统计学意义。造模3 d后，冰敷及消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组;造模7、14 d后，消肿散组、冰敷及消肿散联合组的LDH活性低于损伤模型组;造模14 d后，冰敷组的LDH活性也低于损伤模型组。

LDH活性的降低，说明在各组治疗急性骨骼肌损伤进程中，肌肉组织损害亦渐趋减轻，肌肉组织的修复渐趋增多。其中冰敷及消肿散联合组在造模3、7、14 d后均出现LDH活性的降低，而消肿散组在造模后7、14 d出现LDH活性的降低;冰敷组仅在造模后14 d才出现LDH活性的降低。LDH的活性降低表明，骨骼肌的损伤程度降低。

由此可见，消肿散和冰敷消肿散联合运用均能使损伤的软组织中MDA含量减少和LDH活性降低，对骨骼肌损伤有一定抑制作用，能改善肌肉组织形态修复程度。而冰敷对骨骼肌损伤的抑制作用不明显;冰敷及消肿散联合运用，冰敷没有抵消消肿散对骨骼肌损伤的抑制作用。

3.3 中药外敷及冰敷治疗骨骼肌损伤的认识 有临床研究认为，冰敷联合中药外敷能很好地结合二者的良好功效，能够通过抑制炎性反应细胞或炎性反应因子的渗出、浸润，从而早期缓解疼痛，控制肿胀;同时还能通过改善损伤部位的局部微循环，促进病变的转化吸收，从而促使损伤组织更快的修复[9-12]。

胡劲松等[13]研究发现，消肿散能促进对骨骼肌的修复;同时发现消肿散能使损伤的局部血管再生，能对肌肉组织形态的修复程度有一点改善。由此可见，消肿散既有促进骨骼肌修复的作用，又有一定抑制骨骼肌损伤的作用，双管齐下，促使损伤的骨骼肌尽快恢复。

临床上，对于软组织损伤西医从采用RICE（Rest，Ice，Compression，Elevation），到运动广泛的PRICE原则（Protection，Rest，Ice，Compression，Elevation），发展到2012年英国《运动医学》杂志上强烈建议的POLICE原则[14]，都用到冰敷。与中医的理气活血化瘀的治疗原则不同，中医认为寒性收引凝滞，不利于瘀血得化，宜活血为要。西医的冰敷与中医的活血化瘀的治疗原则相矛盾。而冰敷和中药外用对于软组织损伤均有一定效果，均可缓解疼痛，消除肿胀，减少患者痛苦，提高患者生命质量。有研究表明[15]踝关节扭伤消肿止痛膏组与冰敷组的踝关节肿胀程度、VAS评分疗效比较，差异无统计学意义（P>0.05）。有研究认为冷敷治疗并未能获得更大的终点效益，同时也没有证据表明冷敷影响了关节功能的恢复[16]。有研究表明对于踝关节扭伤三色敷药组治疗比冷敷组治疗效果更好，更好地改善患者的主观疼痛和消除瘀斑等，说明活血化瘀的中药有助于疼痛改善和瘀血消散[17-18]。

消肿散全方药物组成少（芙蓉叶、赤小豆、落得打），效宏力专。其中主药芙蓉叶，性味甘，微辛平，清热解毒、消肿排脓。落得打，又称积雪草，既有活血消肿止痛，又有清热解毒利水的功效。赤小豆甘酸偏凉、其性下行，其效能专在利濕消肿、行血止痛。仅以几味药合用，共奏清热消肿、行血止痛之效。有研究显示，经芙蓉叶提取物治疗后的大鼠，与糖尿病模型组比较，给药组大鼠血清SOD、GSH-PX和肝脏SOD、GSH显著升高，表明木芙蓉叶提取物能提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，增强组织清除自由基的能力[19]。有研究者认为，积雪草具有抑制瘢痕增生、修复皮肤损伤、神经保护、调节免疫、抗溃疡及抗菌、消炎等多种药理作用[20]。赤小豆也含有多种活性物，其不同溶剂提取物都具有一定的抗氧化能力，只是各自抗氧化能力大小存在明显差异[21]。消肿散对急性软组织损伤能较快消除局部受损组织液渗出，抑制炎性反应，促使患部损伤组织修复，改善局部循环从而达到治疗作用[2，22]。经消肿散治疗后，对损伤的骨骼肌，能增强清除自由基的能力以及抗氧化能力，同时还可能有一定抗炎镇痛的作用。

骨骼肌损伤及修复的病理生理机制尚不清楚，在一般以分为4个阶段：坏死、炎性反应、再生和纤维化[23]。在对骨骼肌损伤的治疗干预方面主要有3个方面，即控制炎性反应、提高再生和抑制组织纤维化[24-25]。因此治疗骨骼肌损伤多以减轻炎性反应、增强肌肉再生、抑制纤维化，以提高或恢复肌肉功能并减少复发[13，26-27]。治疗研究方面也大多围绕促进恢复和抑制损伤展开。因此我们认为冰敷对软组织损伤不一定能起到抑制的作用，促进恢复也无明确证据;而中药外用对软组织损伤确有一定抑制作用。

而本研究也存在一些不足，虽然冰敷临床上对软组织损伤有一定效果，但具体的病理生理机制仍尚不明确[14]。消肿散及冰敷消肿联合应用虽然对损伤的骨骼肌组织有一定损伤抑制和修复的能力，但并不能确定作用在整个骨骼肌损伤的再生和修复过程中处于某个具体阶段，即对于其外敷消肿散或冰敷作用的时间节点不能具体到某个阶段。对改善症状如疼痛、肿胀及活动功能情况也未做进一步研究。急性骨骼肌损伤的修复本身是一个很复杂的过程，需要多种物质或细胞因子的参与，实验研究需要更深入的探讨。以期后续研究对疼痛阈值、骨骼肌周径、活动度测量值，以及其他（如IL6、TNFα、CK、SOD、NFG、VEGF等）炎性反应因子、生长因子等深入探讨，进而证实消肿散具有抗炎消肿、活血止痛等作用，更好的指导临床。本实验也为消肿散及其联合冰敷的进一步临床运用和提高奠定了良好的基础，也为揭示消肿外敷治疗急性软组织损伤的作用机制提供一定依据，为临床应用的有效性提供一定的有利依据。

综上所述，消肿散和冰敷消肿散联合运用均能使损伤的软组织中MDA含量减少和LDH活性降低，对骨骼肌损伤有一定抑制作用，能改善肌肉组织形态修复程度。

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（2019-05-02收稿 責任编辑：王杨）