基于网络药理学研究探索复方紫草油治疗肛周湿疹的作用机制

徐克菲 任雪雯 李元文

摘要 目的：应用网络药理学研究方法预测复方紫草油治疗肛周湿疹的有效成分，作用靶点及其潜在的作用机制。方法：通过检索中药系统药理学平台（TCMSP）和中药综合数据库（TCMID）筛选出复方紫草油的有效成分和作用靶点;通过检索人类基因信息数据库（GeneCards）得到肛周湿疹的疾病靶点;通过R语言走脚本得到药物和疾病共同作用靶点;经过Cytoscape软件构建药物-有效成分-作用靶点-疾病的互作网络，探索关键有效成分及靶点;运用STRING平台构建蛋白质间相互作用网络（PPI）进行可视化分析;使用Bioconductor生物信息软件包进行GO功能富集分析和KEGG通路分析。结果：筛选后共得出45个药物有效成分和相应靶点409个，并得到189个疾病相关作用靶点，其中有14个是药物与疾病的共同靶点。富集分析共得到31个GO功能条目和73条KEGG信号通路。结论：复方紫草油治疗肛周湿疹可能是通过IL-6、MMP9、CXCL8、ICAM1和STAT3等蛋白作用，发生细胞因子受体结合、转录因子及核受体活性等生物学过程，并主要富集在African trypanosomiasis、Hepatitis B、AGE-RAGE等多条信号通路上，发挥抗炎和修复屏障等作用。

关键词 网络药理学;复方紫草油;肛周湿疹

Abstract Objective：To predict the effective components，action targets and potential mechanisms of compound lithospermum oil in the treatment of perianal eczema by network pharmacology.Methods：The effective ingredients and targets of compound oleum lithospermi were screened out by searching Pharmacology Platform of Traditional Chinese Medicine System（TCMSP）and Chinese Medicine Comprehensive Database（TCMID）.Human gene information database（GeneCards）was used to select the disease therapeutic targets of perianal eczema.R language was used to run the script to obtain the target of the drug and the disease; Cytoscape software was used to construct the drug-active ingredient-action target-disease interaction network to explore the key active ingredients and targets; the STRING platform was used to build the protein interaction network（PPI）for visual analysis; Bioconductor bioinformatics software package was used for GO function enrichment analysis and KEGG pathway analysis.Results：After screening，a total of 45 drug active ingredients and 409 corresponding targets were obtained.189 disease-related targets were obtained，of which 14 were common targets for drugs and diseases.After enrichment analysis，31 GO functional entries and 73 KEGG signal pathways were obtained.Conclusion：Compound oleum lithospermi in the treatment of perianal eczema may be through the action of IL-6，MMP9，CXCL8，ICAM1，STAT3 and other proteins，resulting in the biological process of cytokine receptor binding，cytokine activity and nuclear receptor activity.These targets mainly concentrated in multiple signaling pathways such as African trypanosomiasis、Hepatitis B、AGE-RAGE，which play key roles of anti-inflammatory and repair barrier.

Keywords Network pharmacology; Compound oleum lithospermi; Perianal eczema

中圖分类号：R285;R242;R275 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.002

肛周湿疹是常见的一种过敏性非传染性皮肤病，常见于婴幼儿及肛周术后患者。以肛周潮湿、瘙痒为主要症状，皮损表现以红斑、丘疹为主，严重者可见糜烂、渗出，部分有搔抓后破溃、结痂，慢性患者可见局部皮肤粗糙肥厚，呈红褐色或灰色，并发有不同程度的苔藓样变[1]。婴幼儿因大小便后，未及时更换尿布或尿布透气性差，长时间尿液浸渍等原因，极易发生肛周湿疹。因长期创面炎性分泌物刺激等因素，导致肛周术后患者也极易病发肛周湿疹[2]。自2019年12月，为抵御新型冠状病毒肺炎疫情，大量的临床医生、社会公职人员、志愿者不畏艰险、坚守临床一线，为人民群众的生命健康护航。尤其是许多一线工作人员因长时间穿戴防护装备，汗液、尿液浸渍，作息无律等，出现了诸多皮肤问题，在一定程度上影响了一线防疫工作。其中以肛周湿疹较为常见，主要体现为肛周，偶有会阴部、股内侧和臀部，出现红斑、丘疹，基底潮红，甚至肿胀、渗液，自觉瘙痒明显。临床上目前尚无特异有效的方法治疗肛周湿疹，因其病位特殊，且局限发病，故多采用外涂皮质类固醇激素等药物改善症状，但停药后极易复发，且激素引起的后期不良反应极大地影响了患者的依从性[3]。

中医外治法源远流长，作为传统疗法，疗效确切，因其药效安全、不良反应小的特点逐渐得到了广泛关注，并在肛周湿疹的治疗中得到应用。部分医家曾通过应用复方紫草油在临床上治疗婴幼儿湿疹和粪水性皮炎取得了良好的疗效[4-5]。李陈等[6]通过使用Meta分析方法证实了局部外用复方紫草油治疗小儿尿布皮炎，可以明显的提高治疗的有效率和治愈率，显著缩短治疗时间，且未见不良反应。朱妮等[7]应用复方紫草油外敷治疗肛周继发性湿疹，疗效确切，不良反应少，与对照组地奈德乳膏治愈率和疗效相当。但是复方紫草油治疗肛周湿疹的确切效应仍未可知。网络药理学作为一种探索中医药干预疾病机制的方法，在近几年得到了广泛应用，它是通过构建药物-靶蛋白-表型-疾病的互作关系网络，并通过Bioconductor生物信息软件进行富集分析来预测药物有效成分在疾病效应靶点中的可能作用机制[8]。因此本文通过使用网络药理学，进行生物系统的网络分析，预测复方紫草油治疗肛周湿疹的有效成分、关键靶点及其潜在的作用机制，以期初步揭示其潜在的作用机制，为后续的临床应用及实验研究提供理论支撑。

1 资料与方法

1.1 复方紫草油的药物有效成分及作用靶点获得  复方紫草油由明代著名儿科专著《幼科金针》中紫草润肌膏化裁而来，药物组成为紫草、冰片、忍冬藤、白芷，以麻油为辅料，采用叶开泰传统工艺制备而成[9]。本研究通过中药系统药理学平台即TCMSP数据库（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[10]和中药综合数据库即TCMID数据库（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/search/）[11]检索复方紫草油中的所有化学成分，再根据成分毒药物动力学ADME[12]参数中类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18[13]作为有效成分的筛选条件，分别筛选出5味中药中高活性的化合物。根据TCMSP数据库中删选后的有效成分，预测其作用靶点。将汇总后的基因靶点全称通过Unitprot数据库[14]注释，得到其對应的蛋白名称及标准化缩写命名。

1.2 肛周湿疹的疾病最终靶点收集 依托人类基因信息数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）检索关键词“perianal eczema”，得到肛周湿疹的疾病最终靶点。

1.3 复方紫草油治疗肛周湿疹的潜在靶点及蛋白互作网络可视化构建 将复方紫草油的药物靶点合并后，比对疾病靶点，运用R语言绘制Venn图，并得到复方紫草油治疗肛周湿疹的潜在靶点;通过STRING平台（https：//string-db.org/）[15]将得到的共同作用靶点构建蛋白质间相互作用网络（PPI），去除图中的单一作用的蛋白质，进行可视化处理。

1.4 药物-关键成分-靶点-疾病网络图搭建 通过运行Cytoscape 3.7.2软件搭建药物-关键成分-靶点-疾病的网络图。图中的4种节点分别代表了药物、关键成分、作用靶点和疾病，连线代表节点之间存在相互联系，连线越密集的加点代表其在治疗中发挥关键作用的可能性越大。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析 通过Bioconductor生物信息软件包将靶点基因进行GO功能[16]和KEGG通路[17]富集分析，并通过Excel和R语言进行可视化柱状图展示。

2 结果

2.1 复方紫草油的药物有效成分及作用靶点获得  通过TCMSP和TCMID数据库检索共得到紫草51个、冰片31个、忍冬藤39个、白芷223个、麻油2个已报道成分[18]。以DL≥0.18对成分进行筛选后，最终得到复方紫草油的有效成分103个，其中紫草35个、冰片5个、忍冬藤16个、白芷45个、芝麻油2个。预测有效成分的相应作用靶点，得到614个基因靶点，其中紫草246个、冰片6个、忍冬藤125个、白芷224个、芝麻油13个。去除重复基因靶点，并对靶点和基因信息进行标准化命名，以物种为“Homo sapiens”剔除后，最终得到115个复方紫草油的关键靶点[18]。

2.2 肛周湿疹的疾病最终靶点收集 在GeneCards数据库中共检索到189个肛周湿疹的潜在靶点，余数据库未检索到疾病相关基因靶点。

2.3 共同靶点筛选及互作网络构建 绘制Veen图，见图1。筛选得到药物、疾病的共同作用靶点共14个，得到靶点具体信息，见表1。将这14个基因导入STRING平台进行得到PPI网络图，见图2，去除1个游离节点，可见13个节点和51条边，平均节点度为7.29。其中每个节点代表由单个蛋白质编码基因产生的所有蛋白质，每条边代表蛋白质与蛋白质的相互作用，包括基因邻里、基因融合、基因共现、同源性、共表达、实验确定、数据库中记录及文字挖掘。统计蛋白出现频次并可视化展示，见图3，可以发现蛋白间相互作用较高的是白细胞介素-6（IL-6）、基质金属肽酶-9（MMP9）、CXC趋化因子配体8（CXCL8）、细胞间黏附分子1（ICAM1）和信号转导子和转录激活子3（STAT3）等，说明复方紫草油的药物有效成分与其有较高的结合活性，可作为其治疗肛周湿疹的潜在靶点。

2.4 药物-有效成分-靶点-疾病网络 分别搭建出复方紫草油治疗肛周湿疹的药物-有效成分-靶点-疾病网络图。见图4。共可见43个节点和78条线。1个蓝色节点代表复方紫草油药物，27个紫色节点代表了药物的关键有效成分，14个橙色节点代表作用的基因靶点，1个红色节点代表疾病。结果显示，复方紫草油治疗肛周湿疹的关键成分可能为熊果酸（Ursolic Acid）和齐墩果酸（Oleanolic Acid），并且可以发现雄激素受体（AR）、孕激素受体（PGR）、细胞间黏附分子1（ICAM1）与多种药物有效成分相关。

2.5 靶点功能及通路分析 本研究通过Bioconductor软件包得到31个GO功能分析条目，将p值靠前的20个GO条目绘制图形。见图5a。横坐标代表该功能上富集的基因数目。可以发现，在细胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding）、核受体活性（Nuclear Receptor Activity）及转录因子活性（Cytokine Activity）等生物学过程中靶点较集中。另一方面，通路富集分析筛选出73条KEGG信号通路，将前20条通路绘制图形。见图5b。横坐标代表该通路上富集的基因数目。可以发现主要在African trypanosomiasis、Hepatitis B、AGE-RAGE等多条信号通路上。见图6。

3 讨论

本研究通过网络药理学研究方法探索了复方紫草油治疗肛周湿疹的可能作用机制。构建复方紫草油的“药物-有效成分-靶点-疾病”网络，共得到45个药物有效成分、14个潜在靶点、31个GO功能条目和73条KEGG信号通路。药物有效成分中，可以发现熊果酸和齐墩果酸综合评分远高于其他化合物。其中熊果酸主要存在于紫草中，可以作为抗炎剂[19-20]、抗菌剂[21]、抗氧化剂[22]，可以调节细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ、TGF-β1等[23]。齐墩果酸具有多种显著的生物活性，可以抑制二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀、组胺升高的大鼠皮肤毛细血管通透性以及乙酸升高的腹腔毛细血管通透性[24]。并且熊果酸、齐墩果酸具有协同作用，均属于五环三萜类化合物，可使肥大细胞难以脱颗粒，降低炎性反应递质的释放，从而起到保护细胞膜和细胞器质膜不易被氧化剂、生物学毒剂等损伤的作用[25]，一定程度上具有抗炎和调节免疫的功效。

汇总分析得到药物和疾病的共同作用靶点共14个，并进行蛋白互作PPI网络分析，可以发现蛋白互作频次较高的是白细胞介素-6（IL-6）、基质金属肽酶-9（MMP9）、CXC趋化因子配体8（CXCL8）、细胞间黏附分子1（ICAM1）、信号转导子和转录激活子3（STAT3）等。IL-6是最常见的淋巴因子之一，主要由巨噬细胞产生，可以通过急性免疫反应、去除病原体、诱导组织愈合等作用来保护机体稳定。IL-6也是各种炎性反应和感染过程中的关键细胞因子，它存在于多种免疫通路中，能够维持免疫反应并促使疾病进展[26]。最近发现，几乎在所有炎性反应性疾病中MMPs的表达均有升高，可能是因为MMPs具有多种功能，涉及到防护、损伤、炎性反应及修复，参与多条反应[27]。其中MMP-9是MMPs中最常见之一，可以调节物理屏障，也可以管理炎性反应遞质，如细胞因子、趋化因子等，MMP-9可以通过在炎性反应组织中控制趋化因子形成梯度变化，以控制白细胞运动到病变部位发挥效应[28]。CXCL8是炎性反应趋化因子，它在感染或损伤过程中浓度升高，与它的CXC趋化因子受体相结合可以募集中性粒细胞浸润并诱发组织炎性反应[29]。ICAM-1可以使白细胞从血管内向炎性反应部位浸润，有助于炎性反应和免疫反应的发生[30]。ICAM-1广泛表达于各种细胞表面，抑制炎性反应部位诱导ICAM-1的表达是改善炎性反应的重要方法，有研究表明，如果ICAM-1的表达被下调和/或细胞因子诱导ICAM-1的表达被抑制，那么炎性反应也将会减弱[31]。STAT3可以刺激T细胞增殖，从而诱导Th17细胞生成[32]。Sano等[33]制备表皮和毛囊角质细胞的Stat3活性缺失小鼠，实验研究发现其毛发和表皮的生成并不受影响，但是毛发的再生长及创伤表皮的修复功能显著受损。故而从靶点蛋白角度推测，复方紫草油治疗肛周湿疹可能是通过抗炎、修复皮肤屏障和调节免疫反应等方面起作用的。

GO功能富集分析中，主要涉及对细胞因子受体结合、转录因子活性及核受体活性等生物过程，涉及STAT3/TNF/IL6/FASLG/CXCL8/PGR/AR等基因靶点，发挥炎性反应、免疫应答、细胞的增值与凋亡等作用。KEGG通路分析中基因靶点数目主要富集在African trypanosomiasis、Hepatitis B、AGE-RAGE等通路上。其中以African trypanosomiasis通路p值最小，置信度最高，涉及ICAM1/TNF/IL6/SELE/FASLG 5个基因靶点，该通路能够通过诱导TNF-α，IFN-γ和IL-1等细胞因子作用于内皮细胞上的SELE和ICAM-1，从而引起炎性反应。

肛周湿疹中医称为“肛门风”，是发生于肛周部位的湿疹，是湿疹的一种，属于中医外科学范畴。最早的具体病名可见于张仲景著写的《金匮要略》：“浸淫疮，黄连粉主之”。其病因复杂，主要可分为内外2个方面：外因可见风、湿、热之邪客于肌表;内因大多为脾胃亏虚或营血不足，致使湿热蕴结或血虚风燥，影响肌表。总的病机可归纳为肛周肌肤或湿热聚集，或失于荣痒，发为肛周湿疹。现代医家认为肛周湿疹主要与感染、过敏、精神、遗传和内分泌等原因相关[34]。复方紫草油在前期药理学研究中已经证实其成分具有抗炎、抗菌、促进伤口愈合等作用，临床疗效稳定[35]。又因其清热凉血，解毒止痛的外治功效，契合肛周湿疹病因病机，故可在临床上尝试应用复方紫草油治疗成人/小儿肛周湿疹，以期疗效。

4 总结

本文通过使用网络药理学，进行生物系统的网络分析，预测复方紫草油治疗肛周湿疹的有效成分、关键靶点及其潜在的作用机制，对于推广复方紫草油治疗肛周湿疹具有重要意义，从理论上阐述了其治疗肛周湿疹具有一定疗效。结果显示，复方紫草油中熊果酸和齐墩果酸等，可能经过African trypanosomiasis、Hepatitis B、AGE-RAGE等通路，作用在IL6、MMP9、CXCL8、ICAM1、STAT3等关键靶点上，发挥抗炎、修复皮肤屏障和调节免疫反应等作用，从而治疗肛周湿疹。说明复方紫草油治疗肛周湿疹是从不同成分、途径、作用产生协同治疗的效果，体现了中医的整体性。然而因为目前网络药理学研究仍不够完善，仅在分子层面上初步揭示其可能作用机制，本实验尚需进行进一步的相关实验来验证结果，以期为本病的治疗提供更多思路。

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（2020-09-09收稿 责任编辑：徐颖）