人参皂苷Rg1对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应中lncRNA NEAT1表达的影响＊

黄舒颖 ，张艳 ，陈鹏飞 ，张诚 ，黄自坤 ，罗清 ，卿城

（南昌大学第一附属医院，1.生殖科；3.药学部；4.超声科；5.检验科；6.重症医学科，南昌 330006；2.江西卫生职业学院护理系，南昌 330052）

脓毒症是由感染原因造成的失控性全身炎症反应，往往在短时间内就可形成危及生命的器官功能损害。虽然对于脓毒症致病机理的研究在不断深入，治疗手段和理念也在不断更新，但脓毒症的死亡率仍然处于较高水平，是当前重症医学领域面临的一项重大挑战。

过度炎症反应是脓毒症早期重要的病理生理特点，巨噬细胞在此过程中发挥重要作用[1]。合理调节巨噬细胞免疫功能，对于脓毒症治疗具有重要意义。作为传统名贵中药材人参主要活性成分之一的人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1），经现代药理学和临床医学研究表明，具有良好的抗炎、抗氧化等多种作用[2]。深入研究人参皂苷Rg1在脓毒症疾病过程中对巨噬细胞炎症免疫反应的调控机制，具有重要的科研和临床价值。

长链非编码 RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200nt的非编码RNA，在脓毒症的发生、发展和预后评估中具有重要作用[3]。我们以往研究表明，脓毒症病人PBMC细胞内lncRNA NEAT1（以下简称NEAT1）表达上升[4]；结核菌感染RAW264.7巨噬细胞可促进NEA T1表达上调，沉默NEAT1可减弱巨噬细胞对胞内结核菌清除能力[5]。即NEAT1是一个炎症反应相关分子，推测其与脓毒症免疫功能密切相关。基于以上认识，我们在体外通过内毒素（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7巨噬细胞构建体外脓毒症炎症反应模型，观察人参皂苷Rg1对巨噬细胞炎症反应的调控作用，以及对NEAT1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 LPS（美国sigma公司）；人参皂甙Rg1（北京生物制品检定所）；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清 （中国杭州四季青公司）；TRIzol试剂和LipofectmineTM 2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；PCR引物 （中国上海生工生物工程公司）；IL-6 ELISA试剂盒 （上海明睿生物技术有限公司）；逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物TaKaRa公司）。其它所用试剂均为分析纯。

1.1.2 细胞系 RAW264.7巨噬细胞系，购买自中国科学院上海细胞研究所。

1.1.3 仪器 荧光定量 PCR仪器 （美国ABI公司Applied Biosystems 7600系统）；二氧化碳培养箱（美国 Thermo）；酶标分析仪（美国 Thermo）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 RAW264.7巨噬细胞种植在含10%胎牛牛血清的DMEM培养基，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养，2-3d换液或传代一次。

1.2.2 实验分组与处理 选取对数生长时期的RAW264.7巨噬细胞加入24孔板，贴壁培养1h，随机进行分组：⑴对照组：未经Rg1和LPS处理；⑵LPS组：加入终浓度10 mg/L的LPS培养6h；⑶Rg1+LPS组：终浓度为5、50μmol/L的Rg1预处理12h 后，分别加入 LPS（终浓度 0.1μmol/L），6h 后分别收集各组分细胞和培养上清用于后续实验，每组实验重复3次。

1.2.3 MTT检测细胞存活率 细胞用胰酶消化，按1×104cells/well种植于96孔板，细胞融合到80%左右时吸去上清液，各孔加20μl MTT溶液，37℃培养箱中继续培养4h，每个孔再加入150μl DMSO，避光震荡10 min让蓝色结晶体充分溶解，于酶标仪490 nm波长处测定各组细胞OD值。

1.2.4 IL-6蛋白测定 细胞用胰酶消化，按照1×106cells/well种植于96孔板，各组分别加入相应成分，按上述1.2.2时间点结束培养，严格按照ELISA试剂盒实验步骤检测培养上清液IL-6浓度。

1.2.5 IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1测定RT-qPCR检测细胞内IL-6 mRNA和lncRNA NEAT1表达，Trizol法提取细胞总RNA，按TakaRa逆转录试剂盒说明书将细胞中RNA逆转录为cDNA；PCR引物购买于上海生工生物公司。以GAPDH为内参基因，各基因引物序列如下：GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'， 下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。NEAT1上游引物：5'-CTTCCTCCCTITAACTTATCCATTCAC-3'，下游引物 ：5'-CTCTTCCTCCACCATTACCAAC AATAC-3'[6]。 IL-6 上游引物：5′-AAACTAGTGAA ATATATCCTGTTGTCAGG-3′， 下游引物序列：5′-GGAAGCTTCCAACATTCATATTGTCAGTTC-3′[7]。qPCR反应采用SYBR Premix EX TaqTM II，使用ABI 7500系统进行上机，具体的检测步骤及反应条件设置都按照试剂盒说明书进行。所有样品做3副孔，RNA相对表达量以 2-△△Ct方法计算所得。

1.2.6 统计学处理 以SPSS19.0统计软件进行分析，数据结果以()表示，两样本均数比较采用t检验，多组间的比较采用ANOVA方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg1对LPS诱导巨噬细胞存活率影响 MTT实验显示，与LPS组比较，50μmol/L的人参皂苷Rg1可提高巨噬细胞存活率，见表1。

表1 Rg1对LPS所致巨噬细胞存活率的影响

2.2 人参皂苷Rg1对LPS诱导细胞炎症因子IL-6蛋白分泌和mRNA表达的影响 实验结果显示，LPS刺激巨噬细胞后，IL-6蛋白和mRNA较空白对照组表达显著上调。加入Rg1后，与LPS组比较，5μmol/L低浓度组Rg1对LPS所致巨噬细胞IL-6蛋白和mRNA表达无明显影响；50μmol/L Rg1组可显著下调IL-6蛋白和mRNA表达 (P＜0.05)，见表2。

表2 Rg1对LPS诱导细胞IL-6蛋白和mRNA影响（n=3,）

表2 Rg1对LPS诱导细胞IL-6蛋白和mRNA影响（n=3,）

与 LPS 组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

1.0±0.1 12.5±3.2 11.8±3.1 5.6±1.7*项目 IL-6（pg/ml） IL-6 mRNA 倍数空白对照组LPS组Rg1（5μmol/L）+LPS 组Rg1（50μmol/L）+LPS 组72.7±8.9 385.5±59.6 357.5±48.4 190.5±19.7**

2.3 人参皂苷 Rg1对LPS诱导巨噬细胞lncRNA NEAT1表达的影响 实验结果显示，LPS刺激巨噬细胞后，NEAT1较空白对照组表达显著上调。加入Rg1后，与LPS组比较，5μmol/L低浓度组Rg1对LPS所致巨噬细胞NEAT1表达无明显影响；50μmol/L Rg1组可显著下调 NEAT1表达 (P＜0.05)，见表 3。

表3 Rg1对LPS所致巨噬细胞NEAT1表达影响()

表3 Rg1对LPS所致巨噬细胞NEAT1表达影响()

与 LPS 组比较：*P＜0.05

1.0±0.1 6.8±2.7 5.9±2.1 2.5±1.1*项目 NEAT1倍数空白对照组LPS组Rg1（5μmol/L）+LPS 组Rg1（50μmol/L）+LPS 组

3 讨论

根据美国宾夕法尼亚州大学2018年在危重病医学杂志发布的一篇研究报告显示，从2010年到2015年，脓毒症在内科和外科住院患者中所占的比例从3.9%上升到9.4%，30天的住院再入院率从2010年的26.4%小幅下降到2015年的23.1%[8]。国内北京协和医院杜斌教授的流行病学研究结果显示，我国外科ICU及综合ICU的严重脓毒症患病率分别为8.7%和37.3%，与来自欧洲的数据相近，由脓毒症造成的死亡人数占12.6%[9]。面对脓毒症如此高的发病率和死亡率，不得不引起医学界在临床科研上的高度重视。

巨噬细胞介导的炎症免疫在脓毒症病理生理过程中扮演关键角色，它作为一种固有免疫细胞，广泛分布于体内各器官、系统，在受到致病微生物感染时，既能吞噬杀灭细菌，又能通过释放炎症介质、趋化因子招募更多炎症细胞，放大炎症反应；还能根据所处微环境变化，选择性极化为促炎的“M1表型”或抑炎的“M2表型”，因而巨噬细胞是机体连接固有免疫反应和适应性免疫反应的重要桥梁[10，11]。在脓毒症早期，巨噬细胞识别炎症刺激分子，启动炎症反应，大量释放炎症因子。我们的研究表明，LPS刺激巨噬细胞6h后，促炎细胞因子IL-6在蛋白和mRNA水平明显上调，促炎症反应过程被启动。

在炎症反应过程中，既有炎症因子的上调，也伴有促炎基因的表达上调。lncRNA是今年来炎症免疫研究新的亮点和热点。如lncRNA CD244可调控结核感染过程中CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α分泌[12]；lncRNA GAS5可促进巨噬细胞呈M1极化[13]。NEAT1也是一个重要的促炎型炎症调控分子，在THP-1免疫细胞中发现它可以调节炎症因子IL-6、CXCL10表达[14]。我们课题组在研究结核菌感染巨噬细胞免疫反应过程中发现，H37Rv感染RAW264.7巨噬细胞后可促进NEAT1表达上调，下调NEAT1表达可减弱巨噬细胞对胞内H37Rv清除能力[6]。新晋吴缅教授课题组研究还发现[15]，N EAT1可以直接参与炎症小体的组装和激活，促进炎症因子IL-1β分泌。另有多篇文献报道RAW264.7细胞中，NEAT1下调可抑制炎症因子IL-6在蛋白和mRNA水平的表达[16，17]。我们研究表明，促炎分子NEAT1在LPS刺激情况下表达上调，与炎症反应过程同步。

抑制过度炎症反应，一直是脓毒症科研和临床治疗的重要方向之一。中医药治疗脓毒症，在2014年写进了中国脓毒症治疗指南[18]。我们根据文献报道[19]及以往的科研经历，选择了具有抗炎活性的传统中药单体活性成分人参皂苷Rg1。经试验证实，人参皂苷Rg1一方面能改善LPS诱导的巨噬细胞存活率降低。另外一方面对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应具有抑制作用，表现为IL-6和NEAT1表达下调。表明人参皂苷Rg1的抗炎机制中，既可以抑制炎症因子表达，也能调控促炎基因NEAT1表达，进一步丰富了人参皂苷Rg1抗炎机理。

综上，本研究实验证实内毒素可诱导巨噬细胞炎症因子IL-6和促炎因子NEAT1表达上调；中药单体成分人参皂苷Rg1具有抗炎作用，其机制可能与抑制IL-6和NEAT1表达有关，该研究为脓毒症科研提供新的思路。