化疗和维生素D3免疫对结核病T淋巴细胞亚群内穿孔素和颗粒溶素表达的影响＊

黄建华，农雪萍，陈艳玲，万引，张爱妹

（江西省胸科医院，南昌 330006）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核病目前仍是严重危及全球的公共卫生问题之一[1]。2016年全球共报道1040万例结核病新发病例，近170万死亡病例与结核病相关[1]。人群中，有近三分之一的人口感染了结核分枝杆菌，大约10%的感染者在其一生中会患上活动性结核病。通过开发有效疫苗和免疫治疗方法，了解宿主对结核分枝杆菌感染的反应机制，是人类抗击结核病的关键。

机体对结核分枝杆菌的免疫反应从肺泡巨噬细胞和常驻树突状细胞吞噬菌体开始。自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性T淋巴细胞通过FasL依赖机制或通过分泌细胞毒性分子杀死受感染的细胞[2，3]。NK 细胞、NKT 细胞、CD4+细胞和 CD8+细胞产生的穿孔素、颗粒溶素和颗粒酶等细胞溶解效应分子在控制Mtb感染中发挥重要作用[4-6]。穿孔素在细胞壁/细胞膜上钻孔，促进颗粒溶素和颗粒酶的进入。颗粒酶B诱导感染细胞凋亡，而颗粒溶素通过增加膜通透性而杀死Mtb[7]。此外，颗粒溶素除了其细胞溶解活性外，还介导炎症反应[8]。据报道，过度的T细胞活化和增殖会在疾病的活跃期引起严重的炎症和组织损伤[9]。提示，宿主免疫反应在感染过程中应当得到适当控制。因此，宿主导向治疗已成为抗结核病的有效的辅助治疗方法。

维生素D3(Vitamin D3，V D3)被认为是一种有效的宿主导向治疗药物，其活性形式1，25（OH）2D3能够下调细胞毒性细胞的过度激活，并在许多自身免疫条件下上调免疫抑制反应[10]。有研究表明，维生素D3作为抗结核药物的辅助药物，能够缩短治疗周期[11]。临床研究显示，补充维生素D3能够改善结核病患者临床症状，抑制抗原刺激的促炎细胞因子反应，并在治疗期间加速炎症反应的减弱[12]。然而，维生素D3对化疗过程中结核病细胞毒性T淋巴细胞亚群内穿孔素和颗粒溶素表达的影响目前尚未见有相关报道。本项研究通过建立小鼠结核病模型，使用流式细胞术观察，维生素D对化疗后小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞中穿孔素和颗粒溶素的表达水平，为结核病的预防、诊治及预后评估开辟新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4-6周龄雄性ICR小鼠，均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。在SPF级屏障系统中饲养，环境温度20-26℃，相对湿度40%-70%。

1.2 主要试剂 CD4和CD8单克隆抗体以及相应同型对照抗体均购自Proteintech（美国），穿孔素和颗粒溶素单克隆抗体及相应同型对照抗体均购自eBioscience（美国），红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，细胞固定和破膜加透化固定试剂盒购自BD（美国），人型 MTB H37Rv由中国药品生物制品检定所捐赠。

1.3 实验分组及处理 将100只ICR小鼠随机分为 5 组：空白对照组（Ctrl）、结核病模型组（TB）、化疗组（C）、结核病维生素D治疗组（VD）和结核病化疗联合维生素D治疗组（C+VD）。空白对照组：ICR小鼠经尾静脉注射1ml无菌生理盐水，并在第4周开始连续腹腔注射生理盐水1ml/只/次 2个月；结核病模型组：ICR小鼠经尾静脉注射1ml结核分枝杆菌混悬液（细菌数109个），并在第4周开始连续腹腔注射生理盐水1ml/只/次2个月；化疗组：结核病模型组ICR小鼠经尾静脉注射1ml结核分枝杆菌混悬液（细菌数109个），常规饲养4周后，每只小鼠每天腹腔注射给予异烟肼（10mg/kg）、利福霉素SV钠（10mg/kg）进行化疗，连续给药8周；维生素D治疗组：ICR小鼠经尾静脉注射1ml结核分枝杆菌混悬液（细菌数109个），常规饲养4周后，在第4、6、8、10周分四次皮内给予维生素D3 0.1mg/只/次；化疗联合维生素D治疗组：ICR小鼠经尾静脉注射1ml结核分枝杆菌混悬液 （细菌数109个），在接受化疗的基础上，同时给予维生素D3。各组小鼠在第4个月初心脏采血，一部分用肝素抗凝，一部分室温静置2h后3000转离心5min取血清。

1.4 流式细胞检测 ⑴细胞表面染色：将采集的小鼠全血平分2个离心管，命名为A管和B管，A管加入适量CD4和CD8单抗，B管加入适量CD4和CD8同型对照抗体，4℃孵育30 min。⑵溶血：每试管加入2 ml红细胞裂解液，轻轻摇匀，室温避光孕育18 min。⑶离心：冲洗2次(每试管加入1ml冲洗液冲洗)200g离心5 min。⑷固定和破膜细胞：重悬细胞后各管加入250μl Fixation/Permeabilization液 4℃孵育20 min。各管加入1mlPerm/WashTM缓冲液冲洗2次 (250 g离心5 min)。⑸标记细胞因子：Perm/WashTM缓冲液重悬细胞后每个样本再分2 管，即 A1、A2、B1、B2。A1 加入适量穿孔素单克隆抗体、A2加入适量颗粒溶素单克隆抗体、B1加入适量穿孔素同型对照抗体、B2加入适量颗粒溶素同型对照抗体 ，避光 4℃孵育30min。各管加入1mlPerm/WashTM缓冲液冲洗2次，冲洗液重悬细胞。⑹上机检测。

1.5 ELISA检测 使用IL-10和IL-17A的ELISA检测试剂盒，检测血清样本中IL-10和IL-17A含量水平，操作步骤严格按照厂家提供的说明书进行。

1.6 数据统计分析 所有实验结果均运用均数±标准误（Means±S.E.M）表示，通过系统统计软件IBM SPSSStatistics 20.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），结果中 P＜0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 维生素D3辅助治疗对穿孔素表达的影响 使用流式细胞术检测各实验组小鼠外周血淋巴细胞穿孔素的表达情况，结果见图1：与健康小鼠相比，结核病模型小鼠淋巴细胞总穿孔素表达水平、CD4+T淋巴细胞穿孔素表达水平以及CD8+T淋巴细胞穿孔素表达水平均显著降低（P＜0.05）；异烟肼（10mg/kg）和利福霉素SV钠药物治疗后，核病模型小鼠淋巴细胞总穿孔素表达水平、CD4+T淋巴细胞穿孔素表达水平以及CD8+T淋巴细胞穿孔素表达水平均显著增加（P＜0.05）；单独使用维生素D3干预，核病模型小鼠穿孔素表达水平未见明显变化（P＞0.05）；与化疗组相比，化疗联合维生素D3治疗的小鼠淋巴细胞总穿孔素表达水平、CD4+T淋巴细胞穿孔素表达水平以及CD8+T淋巴细胞穿孔素表达水平均显著降低（P＜0.05）。

图1 维生素D3辅助治疗对穿孔素表达的影响

2.2 维生素D3辅助治疗对颗粒溶素表达的影响使用流式细胞术检测各实验组小鼠外周血淋巴细胞颗粒溶素的表达情况，结果见图2：与健康小鼠相比，结核病模型小鼠淋巴细胞总穿孔素表达水平、CD4+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平以及CD8+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平均显著降低 （P＜0.05）；异烟肼（10mg/kg）和利福霉素SV钠药物治疗后，核病模型小鼠淋巴细胞总颗粒溶素表达水平、CD4+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平以及CD8+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平均显著增加（P＜0.05）；单独使用维生素D3干预，核病模型小鼠颗粒溶素表达水平未见明显变化（P＞0.05）；与化疗组相比，化疗联合维生素D3治疗的小鼠淋巴细胞总颗粒溶素表达水平、CD4+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平以及CD8+T淋巴细胞颗粒溶素表达水平均显著降低（P＜0.05）。

图2 维生素D3辅助治疗对颗粒溶素表达的影响

2.3 维生素D3辅助治疗对IL-10和IL-17A水平的影响 使用ELISA法检测小鼠血清中IL-10和IL-17A含量水平，结果见图3：与健康小鼠相比，结核病模型小鼠血清中IL-10水平显著降低（P＜0.05），IL-17A 水平显著升高（P＜0.05）；单独化疗和单独使用维生素D3干预后，核病模型小鼠血清中IL-10水平均显著升高（P＜0.05），IL-17A 水平均显著降低（P＜0.05）；与化疗组相比，化疗联合维生素D3治疗的小鼠血清中IL-10水平均显著升高 （P＜0.05），IL-17A 水平均显著降低（P＜0.05）。

图3 维生素D3辅助治疗对IL-10和IL-17A表达的影响

3 讨论

T细胞免疫对于结核病发生发展至关重要，CD4+和CD8+T淋巴细胞在宿主保护中起着关键作用[13]。CD4+和CD8+T细胞能够通过胞吐的形式分泌释放细胞溶解分子 （如穿孔素）和抗菌分子（如颗粒溶素）到细胞毒性T淋巴细胞和受感染靶细胞之间的细胞间突触中。穿孔素可在细胞膜上形成孔，并通过细胞膜修复机制促进颗粒溶素进入受感染的细胞中[14]。研究发现，敲除穿孔素后的小鼠对结核分枝杆菌的易感性明显增加[15]。颗粒溶素在重组后能够杀死多种微生物，包括细菌、真菌、酵母、寄生虫等。它可以通过诱导细胞表面损伤并借助穿孔素破坏细胞内结核分枝杆菌来杀死细胞外结核分枝杆菌[16]。研究表明，肺结核发病部位穿孔素和颗粒溶素表达水平明显低于正常组织和远端肺组织，提示，穿孔素和颗粒溶素表达水平对于结核病的治疗具有重要意义。在本项研究中，我们发现，感染了结核分支杆菌的小鼠T淋巴细胞亚群穿孔素和颗粒溶素表达水平均显著降低，而化疗能够显著提高小鼠T淋巴细胞亚群穿孔素和颗粒溶素水平，与前期研究结果一致[17]。

正常情况下，机体的炎症反应和抗炎反应处于平衡状态。过度的T细胞反应将造成严重的炎症反应，损害机体组织。CD4+T细胞、CD8+T细胞等非常规T细胞表达多种促炎细胞因子，参与自身免疫性疾病的免疫病理过程。一些研究报告说，在许多炎症条件下，IL-17+CD8+T细胞数量增加[18]。此外，CD8+穿孔素阳性细胞的积聚已被证明在慢性感染期间会导致组织损伤[19]。而颗粒溶素重组后的9kDa亚型被证明能够激活促炎症反应[20]。这些发现表明，过度的T细胞活化和增殖会在疾病的活跃期引起严重的炎症和组织损伤。

宿主导向治疗一种新型治疗方法，通过调节宿主在感染过程中的免疫反应来控制疾病的严重程度。1，25（OH）2D3是维生素 D3在体内主要的活性代谢产物。 有报道显示，1，25（OH）2D3能够抑制分枝杆菌抗原刺激的淋巴细胞增殖，降低结核病中IF N-γ 和 TNF-α 阳性细胞数量[21]。 1，25（OH）2D3 还能通过减少对CTL产生至关重要的功能性细胞表面分子的表达，抑制细胞毒性T细胞分化[22]。在本项研究中，我们观察了维生素D3辅助化疗干预对结核病小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞穿孔素和颗粒溶素表达的影响，结果显示，维生素D3辅助治疗能够明显抑制化疗引起的CD4+和CD8+T淋巴细胞穿孔素和颗粒溶素表达上调。进一步的，使用ELISA法检测小鼠外周血中IL-10的含量，发现，维生素D3辅助化疗能够显著提高小鼠外周血中IL-10的水平，并抑制IL-17A表达释放。作为抗炎因子，IL-10能够抑制抗原呈递并在Foxp3+调节性T细胞（Tregs）的分化中起重要作用，后者可控制宿主T细胞在肺中的积累并限制随后的效应子反应[23]。而IL-17A是参与炎症反应的关键炎症因子。以上结果提示，维生素D3可以通过在疾病活跃期调节细胞毒性分子的表达来帮助控制炎症和组织损伤。

综上，在本项研究中，我们观察了维生素D3辅助化疗对结核病小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表达穿孔素和颗粒溶素的影响，结果显示，维生素D3辅助化疗能够明显抑制小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表达穿孔素和颗粒溶素，同时提高小鼠外周血中抗炎因子IL-10的水平。因此，我们认为，补充维生素D3可以控制结核病治疗过程中的炎症反应并增强宿主对抗结核病治疗的反应，从而缩短治疗时间。进一步的应当开展临床试验，以为维生素D3辅助治疗结核病提供更充分的科学依据。