基于问题导向的发酵工程实验设计

刘龙祥

(滨州学院生物与环境工程学院，山东 滨州 256600)

1 实验背景

黄河三角洲土地盐碱地比重大、盐碱程度严重，盐土占滨州市土壤面积的16%。盐碱农田基础设施落后，土壤养分含量低，为追求高产，化肥、农药、地膜普遍过量施用，传统种养模式效益极低甚至亏损，导致农民收入低下，耕作积极性降低，长此以往，农民经济来源得不到保障，无法实现脱贫致富。2018 年中央 1 号文件着重提出：要深入实施“藏粮于地、藏粮于技”战略，稳步提升耕地质量，进行盐碱地改良是保障国家粮食安全的有效途径。现阶段运用较多的养地策略即秸秆还田，但秸秆还田过程中秸秆降解速度较慢是现阶段需解决的关键问题。因此，本节实验以此问题作为导向，引导学生参与实验设计与实施，以期培养学生对实验的全局观念及解决实际问题的能力[1-2]。

2 实验材料与仪器

山东省滨州市盐碱地秸秆还田处地块土壤及秸秆。高压灭菌锅、pH计、超净工作台、培养皿、试管。

3 实验设计与步骤

3.1 培养基配置。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)降解菌筛选培养基：酵母膏 0.1%，蛋白胨 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.1%，NH4NO30.1%，CMC-Na 1.5%、琼脂粉 1.5%，pH 7.5。

刚果红染色液：1 mg/mL

生理盐水：氯化钠0.9%

3.2 样品采集

从山东省滨州市沾化区选取已秸秆还田地块，选择腐解程度中等的玉米秸秆与其表层土壤，装入无菌自封袋，封口带回。

3.3 土壤稀释液制备

称取土壤与秸秆混合物10 g，放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，加入灭菌后的玻璃珠，30℃ 180 r/min振荡30 min，即为10倍稀释土壤悬浮液。在超净台中取该稀释液，进行10倍梯度稀释，最终稀释至10-6。

3.4 平板制备

取已灭菌CMC-Na筛选培养基，在超净台中分别倒入无菌平板中，每个平板约20 mL，每组4个平板，做好标记，自然凝固备用。

3.5 涂布分离及纯化

分别吸取不同梯度的稀释液置于平板上，使用灼烧灭菌冷却后的涂布棒涂布均匀，使平板表明无明显水迹即可，标记稀释浓度与涂布时间等信息。30℃倒置培养，直至长出菌落。单菌落长出后，使用灼烧灭菌冷却后的接种环，挑取单菌落进行平板划线，置于30℃倒置培养，直至长出单菌落。

3.6 CMC-Na降解能力测定

将划线纯化后的单菌落点接种至CMC-Na平板上，30℃倒置培养7 d，在长出菌落的培养基上覆盖配置好的刚果红染色液，染色15 min，倒出染液，加入氯化钠溶液洗涤多余的染液，重复一次，观察菌落周围是否出现透明圈。

4 实验结果与分析

培养基中的纤维素可以与刚果红染液形成红色复合物，当纤维素分解菌在以纤维素为唯一碳源的培养基上生长时，则会形成以纤维素分解菌为中心的无纤维素圈，无纤维素圈在刚果红染液染色后则表现为透明圈，通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。如图1与表1所示，具有CMC-Na降解能力的菌株，可以在菌落周围产生透明圈，透明圈的大小与菌株降解能力直接相关，透明圈越大，降解能力越强。

图1 刚果红染色后的纤维素降解菌

表1 纤维素降解菌数据统计

5 实验设计反思

(1)选择盐碱地中秸秆还田地块，有针对性的筛选具有抗盐碱胁迫的纤维素降解菌，有助于将实验理论与盐碱地改良的实际问题联系起来，使学生对实验设计、实验操作与结果分析过程理解更加透彻。实验设计时长为6学时，纤维素降解菌在平板上的生长周期约7天，可以在三个周次的实验中完成该综合性实验。

(2)土壤微生物种类丰富，我们可以根据不同实验目的，选择不同类型的土壤样本，有针对性的筛选功能微生物，本实验目标明确，针对盐碱地秸秆还田中存在秸秆腐解中存在的问题设计并实施实验，有利于培养学生针对具体实际问题开展科学实验设计与研究的能力[3]。

(3)学生针对本实验进行了相关的资料收集、方案设计、实验准备等相关工作，在预习过程中，针对学生遇见的问题，老师进行讲解。实验结束后，让学生对遇见的问题进行分析，并总结出详细解答方案，并进行全班讨论。这一综合性实验，使学生初步具备了资料收集、实验方案设计、实验方案实施、结果分析及解决实际问题的能力，训练了科学的思维方式，有助于应用型人才的培养[4]。