配合物沉淀法分离大米中直链淀粉的工艺参数优化及产物特性分析

周显青，叶新悦，张玉荣，金珍珍

河南工业大学 粮油食品学院，河南粮食作物协同创新中心， 粮食储藏安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001

目前我国有40%的稻谷在收获后需要储藏，储藏时间一般为16个月[1]。稻谷是具有生命活动的籽粒，在储藏过程中会因为自身的衰老而产生陈化现象。由于稻谷籽粒中脱支酶的存在，支链淀粉在储藏过程中部分脱支导致直链淀粉含量升高，相应的支链淀粉含量降低[2-3]。由于我国稻谷库存量较高，在储藏过程中不可避免地发生陈化，导致品质劣变、口感变差，影响其进一步的加工和成品销售，于是提高陈米的附加值及经济价值引起了研究者的高度关注。糯米与其他稻米最主要的区别是它所含的淀粉以支链淀粉为主，达95%～100%，黏性较高，是制作粽子、汤圆、八宝粥、糯米甜酒等的主要原料，糯米淀粉还具有凝沉性弱、糊黏度和冻融稳定性好的特点，适合制作冷冻食品、脂肪替代物，被广泛应用于冷饮、甜点和药品等方面，市场潜力很大[4]。但是糯稻在我国种植面积小，产量低，价格较贵，因此，寻求一种通过降低陈米中直链淀粉含量而使得支链淀粉含量相对升高的方法将具有广阔的应用前景。分离大米淀粉的方法主要有两种：一是根据溶解度不同进行分离，如配合物分离法、温水抽提法等；二是根据两种淀粉分子结构不同进行分离，如色谱分离和纤维素吸附法[5]。由于色谱法的上样量少、纤维素吸附法的成本高，因此均不适合工业化、规模化分离直链淀粉。Taked等[6]采用配合物选择性沉淀的方法成功地从大米淀粉中提出直链淀粉。程科等[7]研究表明，大米直链淀粉的分离效果受结晶次数、正丁醇浓度等影响。谢涛等[8]研究发现，对橡实直链淀粉得率影响最大的因素是正丁醇纯度。张钟等[9]研究得出纯化次数、分离前的预处理和纯化时的离心时间对粉葛直链淀粉和支链淀粉分离效果均有影响。对红薯[10]、银杏[11]、玉米[12]等均可采用配合物沉淀法分离提纯淀粉，说明此种方法技术成熟、操作简单、提纯效果好、适用性广泛。目前关于应用此方法从大米粉中分离直链淀粉的报道不多，并且研究的侧重点集中在分离后的提纯方面。

作者以陈粳米为原料，基于配合物沉淀法分离工艺，在不脱脂的情况下对大米中的直链淀粉进行分离，以产物米粉中的直链淀粉含量为指标，在单因素试验的基础上进行响应面优化试验，确定最佳分离条件，并以原始米粉和商业糯米粉为对照，对其理化特性进行检测及对比分析，探索产物米粉替代糯米粉的可能性，旨在为陈米的高值化利用提供新思路和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粳米：储藏3 a粳稻谷，黑龙江产；商业糯米粉：大连泰丰米业加工厂。

正丁醇、异戊醇、氢氧化钠、氢氧化钾、无水乙醇、盐酸、丙三醇、甲醇、碘、碘化钾、95%乙醇、乙酸、麝香草酚蓝、石油醚等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

锤式旋风磨JXFM110：上海嘉定粮油仪器有限公司；TGL-18MS高速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DK-98电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；新飞冰箱BCD-241：河南新飞电器有限公司；PHS-3C精密pH计：上海大普仪器有限公司；101C-3电热鼓风干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；CNS-1211超声波萃取仪、CNS-2100B直链淀粉速测仪：长春长光思博光谱技术有限公司；凯氏定氮仪UDK152：美国英思科公司；RVA-TecMaster快速黏度分析仪：澳大利亚波通公司；SX-2-5-12箱式电阻炉：天津市中环实验电炉有限公司；MVS-1旋涡混合器：北京金北德工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米粉的制备

将粳米样品用锤式旋风磨粉碎，至样品粒度为全部通过100目标准分样筛，并将样品进行标注，在室温下储存。

1.3.2 大米直链淀粉分离

工艺流程：大米粉→无水乙醇润湿→分散淀粉→加热搅拌→冷却→离心→调节pH值→加入正丁醇-异戊醇→水浴→冷却后冷藏→离心→上清液→真空浓缩→冷的无水乙醇沉淀→洗涤沉淀→干燥→粉碎过筛→产品。

称取10 g经处理后的米粉样品放入烧杯中，加入15 mL无水乙醇浸润，轻摇烧杯使米粉溶解，再缓慢加入250 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液，并置于100 ℃水中加热，搅拌10 min，溶液分散均匀后冷却至室温，低速离心除去不溶物，淀粉糊用2 mol/L的HCl调至pH值至中性，再边搅拌边缓慢加入200 mL体积比为3∶1的正丁醇-异戊醇溶液。在沸水浴中加热20～30 min，使溶液清澈透明，无结团状。冷却至室温，于2～4 ℃冰箱中放置24 h，取出，8 000 r/min离心20 min。取上清液，真空浓缩后加入冷的无水乙醇进行沉淀，再以每次150 mL无水乙醇洗涤沉淀物5或6次后，于电热鼓风干燥箱中40 ℃干燥8 h。粉碎过100目筛，得到产品。

1.3.3 单因素试验

以米粉的直链淀粉含量为指标，分别探索正丁醇与异戊醇体积比(1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1)、分散温度(70、80、90、100 ℃)、搅拌时间(5、10、15、20、25、30 min)、溶液pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)对以配合物沉淀法提取的米粉直链淀粉含量的影响。

1.3.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，选择正丁醇与异戊醇体积比、分散温度及溶液pH值为影响因素，以产物的直链淀粉含量为响应值，依据Box-Behnken中心组合设计三因素三水平响应面试验，因素与水平见表1。

表1 响应面因素与水平Table 1 The response surface design

1.3.5 相关指标的测定

直链淀粉含量按照GB/T 15683—2008进行测定；灰分含量按照GB/T 5009.4—2016进行测定；粗蛋白含量按照GB 5009.5—2016进行测定；粗脂肪含量按照GB 5009.6—2016进行测定；胶稠度按照GB/T 22294—2008进行测定；糊化特性按照GB/T 24853—2010进行测定。

1.3.6 凝沉性的测定

根据刘政等[13]的方法并稍作修改。准确称取0.5 g(干基)米粉，置于100 mL烧杯中，加入50 mL蒸馏水混匀，配制成1%的淀粉乳。将盛有淀粉乳的烧杯置于沸水浴中，边加热边不断搅拌20 min，加热结束后转移到50 mL的具塞试管中，静置24 h后对下层凝沉物的体积进行测定并记录。

1.3.7 溶解度和膨润力的测定

根据李琳等[14]的方法并稍作修改。准确称取0.5 g(干基)米粉(M)，置于40 mL离心管中，加入10 mL蒸馏水，配制成5%的淀粉乳。混匀后在45 ℃恒温水浴振荡锅中振荡30 min，4 000 r/min离心15 min，再将上清液于120 ℃烘干至恒质量(m)，计算溶解度(S)；下层沉淀为膨胀淀粉，称质量(n)后计算膨润力(F)。

1.3.8 保水力的测定

参照周显青等[15]的方法。准确称取0.1 g(干基)的米粉(m，g)置于40 mL离心管中，离心管质量为M(g)，加入10 mL蒸馏水，配制成1%的淀粉乳。混匀后在80 ℃恒温水浴振荡锅中振荡1 h，3 000 r/min离心20 min，然后倒掉上清液，对沉淀物及离心管一并称质量(N，g)，计算米粉保水力(W)。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 正丁醇与异戊醇体积比对直链淀粉含量的影响

在其他因素(分散温度100 ℃、搅拌时间10 min、溶液pH 7)不变的情况下，正丁醇与异戊醇体积比(1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1)对直链淀粉含量的影响见图1。

图1 正丁醇与异戊醇体积比对直链淀粉含量的影响Fig.1 Effect of the ratio of n-butanol to isoamyl on amylose content

由于大米中直链淀粉与支链淀粉分子结构的差异性，直链淀粉在溶液状态下分子伸展时易与一些极性有机物(如醇类、脂肪酸等)通过氢键缔合形成结晶性化合物而沉淀。而支链淀粉分子由于在溶液中呈分枝状，在空间上存在位置阻碍作用，不易与醇类等极性有机物结合形成沉淀[16]。由图1可以看出，产物中直链淀粉的含量随着正丁醇与异戊醇体积比增加呈先下降后上升的趋势,在比例为2.5∶1时米粉中的直链淀粉含量最低，为4.84%。当正丁醇与异戊醇体积比达到4.0时，直链淀粉含量升高至6.36%。这可能是因为当两种醇的体积数一定时，随着正丁醇溶液的增加，更多的直链淀粉被络合形成沉淀，在后面的离心处理中除去，所以直链淀粉含量有所降低。但是随着正丁醇的继续增加，溶剂黏度过大而阻碍了直链淀粉分子的扩散与正丁醇结合，导致直链淀粉含量上升。因此，选择正丁醇与异戊醇体积比为2.5∶1。

2.1.2 分散温度对直链淀粉含量的影响

固定正丁醇与异戊醇体积比3.0∶1、搅拌时间10 min、溶液pH 7时，分散温度(70、80、90、100 ℃)对直链淀粉含量的影响见图2。

图2 分散温度对直链淀粉含量的影响Fig.2 Effect of dispersion temperature on amylose content

在淀粉中由于直链淀粉和支链淀粉通过氢键缔合形成结晶胶束区，淀粉分子在常温水中是不溶的，但是随着温度的上升，淀粉颗粒开始膨胀，直链淀粉分子充分伸展，将极性基团外露，易与正丁醇、异戊醇等一些极性有机化合物通过氢键缔合形成结晶型化合物而沉淀[6]，由图2可以看出，产物中直链淀粉的含量随着温度的升高呈现不断减少的趋势。分散温度100 ℃时，直链淀粉含量最低，为6.75%。分散温度为90 ℃时，直链淀粉含量下降十分明显，为6.95%，而在90 ℃之后直链淀粉含量就没有太大的变化，90～100 ℃的降幅仅为2.9%。这可能是因为分散温度为80 ℃时，淀粉粒开始溶胀、分裂，随着温度升高，淀粉粒分散更充分。温度超过90 ℃时，淀粉粒已接近分散完全，所以直链淀粉含量下降并不明显。因此，选择分散温度为90 ℃。

2.1.3 搅拌时间对直链淀粉含量的影响

在其他因素(正丁醇与异戊醇体积比3.0∶1、分散温度100 ℃、溶液pH 7)不变的情况下，搅拌时间(10、15、20、25、30 min)对直链淀粉含量的影响见图3。

图3 搅拌时间对直链淀粉含量的影响Fig.3 Effect of stirring time on amylose content

在较高的分散温度下，部分淀粉会迅速糊化凝结，从而使得淀粉团粒分散不均，辅助搅拌可增强分散效果，增大反应的彻底性。由图3可以看出，产物中直链淀粉的含量随着搅拌时间的延长呈现出先减少后增多的趋势。并且搅拌时间为10 min时，直链淀粉含量最小，为6.36%。说明搅拌的辅助作用得到了发挥，在10～15 min时直链淀粉的含量变化不明显，搅拌时间20 min时产物中直链淀粉的含量又迅速上升至10.2%。搅拌时间超过20 min，直链淀粉含量呈缓慢上升趋势后趋于稳定。说明适度的搅拌利于淀粉的充分分散，而后随着搅拌时间的延长，可能会使体系中部分支链淀粉发生脱支，产生直链淀粉及中间组分，直链淀粉含量反而升高。因此，选择搅拌时间为10 min。

2.1.4 溶液pH值对直链淀粉含量的影响

在固定正丁醇与异戊醇体积比3.0∶1、分散温度100 ℃、搅拌时间10 min的条件下，溶液pH值(6.0、6.5、7.0、7.5)对直链淀粉含量的影响见图4。

图4 溶液pH值对产物中直链淀粉含量的影响Fig.4 Effect of solution pH value on amylose content

由图4可以看出，产物中直链淀粉的含量随着溶液pH的增加呈现出先减少后增多的趋势。在溶液pH 6.5时，直链淀粉含量最低，为6.02%。当pH 7.5时，直链淀粉含量明显增多至11.09%，这可能是因为在碱性环境下，会降低正丁醇、异戊醇跟直链淀粉的络合程度，从而影响直链淀粉分离。而当pH值为6.0～7.0时，直链淀粉含量变化不大。因此，选择溶液pH值为6.0～7.0。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验与分析

在单因素试验的基础上，选取对产物中直链淀粉含量影响较大的3个因素：正丁醇与异戊醇体积比、分散温度、溶液pH值，采用Design-Expert 8.0.5设计响应面优化试验，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Experimental results of response surface analysis

利用Design-Expert 8.0.5对表2的数据进行回归拟合，得到的二次多项回归方程：Y=3.85+0.66A-0.33B-2.11C-0.96AB-0.59AC-0.37BC+2.51A2+1.73B2+1.63C2，方差分析见表3。由表3可知，模型P<0.000 1，为极显著水平，失拟项P=0.075 6>0.05，不显著，说明该试验设计可靠，可用该模型来分析和预测此工艺下产物中直链淀粉含量的变化。C、AB、A2、B2和C2均对产物中直链淀粉含量有极显著影响，A对产物中直链淀粉含量有显著影响。由P值可知各因素对产物中直链淀粉含量影响的顺序为分散温度>正丁醇与异戊醇体积比>溶液pH值。其中，正丁醇与异戊醇体积比与分散温度对直链淀粉含量的交互作用达到极显著水平。

表3 响应面模型的方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

各因素交互作用对产物直链淀粉含量影响的响应面曲面图和等高线如图5—图7所示。等高线的形状可反映出各交互作用的强弱，如果是圆形，则表示两因素交互作用不显著，如果为椭圆，则表示两交互作用显著[17]。响应面曲面图的曲面形状可以反映出影响因素的显著水平，如果曲面较陡，则说明影响显著，如果曲面较圆则说明影响不显著[18]。

由图5可知，当分散温度一定时，随着正丁醇与异戊醇体积比和溶液pH值的增加，直链淀粉含量呈现出先减小后增大的趋势。当正丁醇与异戊醇体积比在2.5左右，溶液pH值在6.5左右时，直链淀粉含量有最小值。从响应面曲面图可以明显看到正丁醇与异戊醇体积比的曲面变化比溶液pH值的曲面变化更陡，说明正丁醇与异戊醇的体积比对直链淀粉含量的影响更显著。

图5 正丁醇与异戊醇体积比和溶液pH值对直链淀粉含量影响的曲面图及等高线Fig.5 Response surface plot and contour map of the effects of the ratio of n-butanol to isoamyl and pH value on amylose content

图6 正丁醇与异戊醇体积比和分散温度对直链淀粉含量影响的曲面图及等高线Fig.6 Response surface plot and contour map of the effects of the ratio of n-butanol to isoamyl and dispersion temperature on amylose content

图7 分散温度与溶液pH值对直链淀粉含量影响的曲面图及等高线Fig.7 Response surface plot and contour map of the effects of dispersion temperature and pH value on amylose content

由图6可知，当溶液pH值一定时，随着正丁醇与异戊醇体积比的增加，分散温度引起的直链淀粉含量的变化较大。当体积比在2.5左右，分散温度在95～97 ℃时，直链淀粉含量有最小值。等高线的形状为椭圆形，说明两因素的交互作用对直链淀粉含量的影响较显著。

由图7可以看出，分散温度的变化对直链淀粉含量影响较大。当分散温度在95～97 ℃，溶液pH值在6.5左右时，直链淀粉含量有最小值。

2.2.2 验证试验

通过响应面试验优化后，确定最优工艺条件：正丁醇与异戊醇体积比2.49，溶液pH 6.58，分散温度96.61 ℃。产物中直链淀粉含量理论值为3.12%。为了验证实际试验结果与模型预测结果的符合程度，且为方便操作，将最佳工艺参数进行修正：正丁醇与异戊醇体积比2.5，溶液pH 6.58，分散温度96.6 ℃。进行3次重复试验，制得的产物中直链淀粉含量为3.23%，与模型的预测值基本吻合。说明通过响应面优化后该分离方法的最佳工艺条件可靠可行，具有实用价值。

2.3 产物理化特性分析

2.3.1 理化特性(表4)

表4 米粉的理化特性Table 4 Physico-chemical properties of rice flour

由表4可知，产物米粉的直链淀粉含量显著低于原始米粉，而与糯米粉的直链淀粉含量无显著差异。相对于原始米粉，产物米粉的粗蛋白与粗脂肪含量显著减少，这可能是因为在碱性环境中,足够的水会促进蛋白质和脂质的溶出所致。但产物米粉的灰分含量显著增加，这是因为该分离方法为了加速淀粉的分散加入NaOH溶液，而处理过的米粉由于吸附了Na+而使灰分含量升高。

淀粉凝沉性可用淀粉糊的沉降体积来描述。赵全等[19]研究表明，淀粉中直链淀粉含量越低，沉降值越小，凝沉性越好，形成凝胶的能力也越强。由表4可知，与原始米粉相比，产物米粉的沉降体积下降幅度较大，而与糯米粉无显著差异，产物米粉的凝沉性优于糯米粉，这是因为凝沉性与直链淀粉含量有关。直链淀粉含量越高，凝沉得越快，沉降体积越大，凝沉性越弱。直链淀粉分子排列较规整，因此更容易进行重排和缔合，从而发生凝沉现象[20-21]。

在45 ℃条件下测定的3种米粉溶解度与膨润力大小，反映了淀粉颗粒在加热过程中与水分子之间相互作用的大小及在一定离心下的持水力[22]。3种米粉的溶解度均低，原始米粉的最低，产物米粉的最高。米粉的膨润力结果显示，糯米粉最高，产物米粉次之，原始米粉最低。产物米粉的溶解度和膨润力与糯米粉均无显著差异，而原始米粉的溶解度和膨润力均明显低于糯米粉和产物米粉。由于直链淀粉形成的较封闭的双螺旋结构而倾向抑制水的流动性[23]，并且米粉溶解性与其直链淀粉含量成反比，这与余世峰[24]的研究一致。产物米粉的溶解度和膨润力高于原始米粉，这也可能是因为米粉中蛋白质及脂质等成分对溶解性有所影响，贾喜午等[25]研究表明，蛋白质、脂肪对大米淀粉的溶解度和膨润力均有抑制作用。

由表4可知，原始米粉的胶稠度明显低于糯米粉及产物米粉。淀粉中所含直链淀粉越多，越容易回生形成凝胶，降低胶稠度，这与黄梅婷[26]的研究一致。淀粉颗粒与水分子由羟基相连，羟基数目决定了淀粉的保水力，淀粉中能够与水分子相互作用的羟基数目与淀粉的结构与组成成分有关。淀粉颗粒结晶区遭到破坏时，水分子可能会进入到结晶区与亲水基团结合[27-28]。原始米粉的保水力最小，产物米粉最大。说明产物米粉的保水力明显高于原始米粉。因此，相对于未处理的原始米粉，该分离工艺得到的产物米粉可明显提高米粉的保水力。

2.3.2 糊化特性

由表5可以看出，除峰值黏度、衰减值，产物米粉的最低黏度、最终黏度、回生值、峰值时间、糊化温度均低于原始米粉。而产物米粉的峰值黏度、最低黏度、最终黏度、回生值均高于糯米粉，产物米粉的衰减值、峰值时间、糊化温度均低于糯米粉。产物米粉的峰值时间、糊化温度均比原始米粉低，而与糯米粉的相近，这是因为原始米粉中直链淀粉含量较高，而支链淀粉易发生糊化所造成的。产物米粉的峰值黏度比糯米粉高，说明其在糊化升温过程中米粉中的淀粉颗粒膨胀程度更大。这可能是因为淀粉在水中的渗透情况、淀粉颗粒膨胀性及淀粉颗粒结构等原因造成黏度的不同。峰值黏度与最低黏度之差为衰减值，反映的是淀粉糊在高温下耐剪切的能力。产物米粉的抗剪切能力优于原始米粉且和糯米粉较为接近。产物米粉的回生值与糯米粉比较相近，说明产物米粉在糊化后的冷却过程中重结晶能力与糯米粉相似。

表5 米粉的糊化特性Table 5 Gelatinization properties of rice flour

3 结论

在配合物沉淀法分离直链淀粉的工艺试验中，通过单因素试验和Box-Behnken中心组合试验探索了正丁醇与异戊醇体积比、搅拌时间、溶液pH值及分散温度对分离效果的影响，确定最佳工艺条件：正丁醇与异戊醇体积比2.5∶1、溶液pH 6.58、分散温度96.6 ℃，在此工艺条件下得到的产物中直链淀粉含量为3.23%。其中大米粉的分散温度对最终直链淀粉的分离效果影响最大，溶液pH值影响最小。

原始大米粉与产物米粉最明显的差异是直链淀粉的含量，该分离方法在最优工艺条件下得到的产物中直链淀粉含量已接近糯米粉，甚至低于糯米粉，而显著小于原始米粉。产物米粉中蛋白质与脂肪含量比原始米粉低，灰分含量比处理前高。产物米粉的凝沉性、溶解度、胶稠度、膨润力、保水力均比原始米粉有所增大，且接近甚至优于糯米粉。在糊化特性上，产物米粉的回生值、糊化温度、峰值时间相比于原始米粉显著降低，而与糯米粉接近，且其抗剪切能力高于原始米粉而更接近糯米粉。可见，产物米粉性质与糯米粉接近。