鲁西南地区4种鸭源重要病毒感染的调查与分析

逯 璐，朱广伟，于 森，丁雅苓，张 琳*

(1. 山东管理学院 新兴业态发展研究所，山东 济南 250357；2. 齐鲁师范学院，山东 济南 250013；3. 山东省农业科学院 畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100；4. 齐鲁动物保健品有限公司，山东 济南 250100)

中国是世界上鸭(Anasplatyrhynchos)品种最多、肉蛋产量最大的国家。近年来，随着养殖规模和存栏量的持续增长，疫病尤其是病毒性传染病对养鸭业的危害日益严重。水禽流感、鸭坦布苏病毒病、鸭病毒性肝炎等在鸭群中持续传播[1-3]，鸭新城疫“老病未除”，又呈现出新的症状[4]，造成鸭群大量死亡或产蛋下降，经济损失巨大。此外，鸭还是流感病毒这一人畜共患病毒病的重配来源和重要中间宿主之一[5]，如自2013年中国出现人感染 H7N9 流感病毒以来，至少已经历了5波疫情[6]，对公共卫生产生了极大的危害。因此，掌握鸭群中重要病毒的流行状况不仅能够为传染病的流行提供预警，减少养鸭业的经济损失，而且能够在源头降低甚至消灭鸭源人畜共患病的跨种间传播，保障人类健康。

2019年，课题组对鲁西南地区不同养殖规模的水禽养殖场进行了分子流行病学调查，重点对流感(avian influenza virus, AIV)、新城疫(Newcastle virus, NDV)、坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)和鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)4种鸭源重要病毒的感染情况进行了调查与分析，旨在明确4种病毒的区域流行状况，为科学有效防控措施的制定提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

1.2 样品采集

在鲁西南地区的菏泽、济宁和聊城选取不同规模养殖场疑似发病鸭进行样品的采集，包括病变组织、咽喉/泄殖腔棉拭子，全年不定期采样。病料采集后放入含有双抗的生理盐水中，置于冰盒或者干冰中，尽快送至实验室，-80 ℃保存。

1.3 引物的设计与合成

根据NCBI已登录的鸭源AIV、NDV、TMUV、DHV基因序列，分别于保守区设计特异性引物，序列及扩增片段长度见表1。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 基因扩增引物序列Table 1 Nucleotide sequence of primers

1.4 病毒核酸提取及PCR扩增

将病料组织切成小块，取小部分置于离心管中，加入PBS缓冲液(pH7.2)充分研磨，后置于离心机中离心5 min(12 000 r/min，4 ℃)，收集上清，加入TRIzol开始提取病毒核酸。棉拭子样品直接使用TRIzol进行病毒核酸的提取。方法参照试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 AIV、NDV、TMUV和DHV的感染情况

740份样品检测出AIV的病料298份，阳性率为40.27%；NDV阳性样品102份，阳性率13.78%；TMUV阳性的样品128份，阳性率为17.30%；DHV阳性样品50份，阳性率6.76%。

2.2 4种鸭源病毒在不同时间的感染状况

对不同时间段内鸭群感染AIV、NDV、TMUV和DHV的状况进行了统计。结果如表2所示，AIV和NDV在第1和第4季度的阳性率较低，而在第2和第3季度时的感染率明显升高；与之相反，TMUV的感染率在1-3月和10-12月间较高，而在4-9月间处于较低水平；DHV的检出率较为平稳，各时间段内差异不大。

表2 AIV、NDV、TMUV和DHV阳性率统计结果/%Table 2 Positive rate of AIV, NDV, TMUV and DHV

2.3 AIV、NDV、TMUV和DHV的混合感染情况

在所有的检测样品中，有112份存在混合感染，即检测出至少2种病原，混合感染率为15.14%。AIV/NDV的混合感染56份，混合感染率为7.58%；AIV/TMUV的混合感染20份，混合感染率为2.7%；AIV/DHV的混合感染有16份，混合感染率为2.16%；AIV/NDV/DHV的混合感染6份，混合感染率为0.81%；NDV/TMUV和NDV/DHV混合感染均为4份，混合感染率为0.54%；TMUV/DHV、AIV/NDV/TMUV和AIV/TMUV/DHV混合感染均有2份，混合感染率为0.27%。结果表明，鲁西南地区的鸭群中存在AIV、NDV、TMUV和DHV混合感染，在现有的检测结果中以2种和3种目标病原的混合感染为主，不存在四种目标病原的混合感染。

3 讨 论

鸭被认为是AIV和NDV巨大的天然储存库，16种HA和9种NA亚型的AIV在水禽中被发现[8]，中低毒力或无毒力的NDV毒株也广泛存在于鸭群之中[9-10]。同时，水禽之前也仅仅被认为是AIV和NDV的携带者而不会发病致死，但20世纪90年代H5N1等高致病性AIV和NDV引起鸭、鹅高发病率和高致死率，彻底打破了这一传统认识[11-13]。随着水禽养殖规模的不断扩大，AIV和NDV对鸭致病致死率不断攀升。究其原因，鸭体内存在如此多亚型AIV，为病毒的变异重组提供了便利，极易产生毒力增强的毒株[14-15]；而NDV在受到自然选择压力(特别是免疫压力)时，自身核酸的突变会加速，压力越大则速度越快，加之在复制过程中RNA聚合酶缺少对核酸的严格校对功能，故原本广泛存在的中低毒力或无毒力毒株可能转变为中高毒力或者高毒力毒株[4,16]。所以，加强AIV和NDV的流行病学监测，强化鸭群带毒情况的调查对鸭AIV和NDV的防控至关重要。在本研究中，AIV的阳性率在4种病毒中是最高的，达到40.27%，表明AIV的感染在鸭群中仍然普遍存在，依然是防控的重点。后期课题组对AIV检测阳性的RNA进行了HA亚型的鉴定，包含H9、H7、H5、H4等多个亚型，并以H9、H7、H5为主未报道，所以在养殖过程中，需要根据流行病学调查结果选择相应的疫苗进行预防接种。NDV的检出率为13.78%，感染和带毒率虽然比AIV低，且毒株大部分为低毒力毒株，但鉴于NDV毒力的演变进程[9,16]，仍需作为鸭群的防疫重点进行预防，加强生物安全的管理，选择与流行株一致的疫苗进行免疫，利用综合防控手段防治强毒疫情的发生。

根据AIV和NDV各季度阳性率变化情况发现，两者流行趋势类似，在第1和第4季度阳性率较低，而第2和第3季度明显升高。虽然统计结果跟往年的流行状况有所区别，可能会受到样品采集、检测误差等方面的影响，但经后期的分型检测发现，在2019年阳性率较高的时间段内，鸭群流行H9亚型AIV，而1、4季度主要流行H5、H7亚型，对于后两种亚型养殖场常会选择对型免疫，防疫措施到位，而对弱毒力的H9往往不够重视。鸭在感染H9后，很容易诱发其他病毒的感染[17-18]，从混合感染的统计情况来看，也证实了这一点，与AIV的混合感染最多，可占到混合感染病例的91.07%，其中与NDV的混合感染最多，占到一半以上，所以在AIV发病较多的时间段内，NDV的发病率也较高。所以，要绝对重视H9亚型AIV的感染与流行。

坦布苏病毒于2010年在中国主要养鸭区域集中爆发，主要引起产蛋鸭产蛋率骤降、肉鸭和育成鸭死亡[19]，近年来已成为中国水禽养殖业常见疫病之一。黄病毒大多为蚊媒或虫媒病毒，坦布苏病毒虽然也可依靠蚊子传播，但其关键位点上的突变使其获得了不依靠蚊媒而进行传播的能力[20]，其中包括接触传播，所以对该病进行密切监测对于疫情的控制十分必要。本研究中，感染坦布苏病毒的病料有128份，阳性率为17.30%，说明该病毒在鸭群中仍然存在，即使大规模应用了弱毒疫苗进行预防，发病也十分常见，提示生物安全措施不可松懈。值得注意的是，统计结果中坦布苏病毒在春冬季节发病率较高，而在夏天(7-9月)发病率较低，除与采样有关外，与其不耐热的生物学特性和具备了不依赖蚊子的传播特性关系密切[20-21]，同时还与养殖场(户)不进行疫苗免疫或者鸭群在免疫前发病的情况相关。

鸭病毒性肝炎病毒主要感染雏鸭，其特点是发病急、传播快、病程短、死亡率高[22]，虽可依靠疫苗接种预防此病，但病毒的早期监测才是有效防控的关键。从2019年采集的病料检测结果来看，DHV 6.76%的阳性率表明该病处于低流行状态，其中一半感染属于混合感染，说明继发感染是诱发此病的主要原因。

4 小 结

本研究对2019年鲁西南地区4种鸭源重要病毒的感染情况进行了调查，发现AIV仍然是主要感染病原，且多存在混合感染和引起继发感染；AIV和NDV流行于第2、3季度，而坦布苏病毒感染多发生于第1、4季度。结果为该地区鸭主要疫病流行状况的诊断和防控措施的制定提供了可靠依据。