温度与pH 值对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活力的影响

李 菊，王 玮

（青岛海洋科技馆，山东 青岛 266003）

水母是一类分布十分广泛、种类众多、数量及其庞大的海洋生物，以其绚丽的色彩、梦幻般的形态引起了人们的关注。关于水母饲养的饵料、光照和温度等条件已摸索成熟[1-3]，但是在饲养过程中还是会遇到由于营养问题导致的碟状体发育不全、水母成体伞径过小、伞体外翻或游动动力不足等情况。为了更好地寻找水母适口饵料、增强营养摄入，需要全面了解水母消化酶理化性质，以分析水母更易消化吸收的营养成分。然而，目前关于水母消化酶的研究还处于初步阶段，仅有僧帽水母（Physalia arethusa）、沙海蜇（Stomolophus meleagris）、海蜇（Rhopilema）和海月水母（Aurelia aurita）消化酶粗液的少量研究[4-6]，仍有大量水母的消化酶的理论研究亟待补充。

大西洋金黄水母（Chrysaora quinquecirrha），隶属于 钵水母纲（Scyphozoa）、旗口水母目（Semaeostomeae）、游水母科（Pelagiidae）、金黄水母属（Chrysaora）。该水母体色通常为乳白色或浅黄色，伞体直径可达19 cm，触手多且极细长，具有很高的观赏价值，现已成为国内海洋馆和水族馆常规饲养的种类。试验对大西洋金黄水母胃丝中的蛋白酶活性进行测定，初步研究了大西洋金黄水母胃丝蛋白酶对不同温度的响应规律，以期为了解水母消化酶的生理生物学研究提供参考，也为水母饲养条件的优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集试验材料来自青岛海产博物馆水母缸，由同一批次大西洋金黄水母碟状体发育形成。这些水母体伞径为9.0 cm ± 1.0 cm，游动速度正常，形态完整，肉眼可见明显胃丝，未发生排精或授精。

大西洋金黄水母饲养所用的海水为粗过滤处理的青岛近岸天然海水，盐度为33，pH 值约为8.0，控制水温在22～24 ℃浮动。日常以卤虫无节幼体为水母 饵料。

1.1.2 主要仪器蛋白定量测试盒（南京建成科技有限公司）；恒温培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司，LBI-250）；水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，DK-8D）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备先将所有实验用大西洋金黄水母集中放置于同一个水母培养箱中，饥饿处理24 h 以排除胃丝中残存食物的影响。从水母缸中小心取出，转移入实验室内。将水母用0.22 μm 孔径过滤的海水冲洗干净，放入无菌的培养皿中，于解剖镜下观察胃丝的位置和生长状况，之后迅速用1 000 μL 移液枪吸取胃丝组织。将胃丝组织转移到到已低温预冷的无菌匀浆器中。低温研磨，并低温离心15 min，吸取上清液，即得所需样品。将样品放置于冰板上保持低温状态以进行下一步试验，其余样品则分装后长期保存于-80℃超低温设备中。

1.2.2 蛋白酶活性的测定根据海月水母蛋白酶活力的试验结果[6]，选取37 ℃、pH 8.0 为试验条件，使用福林-酚试剂法[7]测定大西洋金黄水母的蛋白酶活性。

为定量光密度（OD）与样品中的酪氨酸含量（μg）的线性关系，选用酶活力同样的试验条件测定梯度酪氨酸溶液的光密度，绘制酪氨酸曲线。

酪氨酸标准曲线方程：C=1 008×A-0.145。C 为样品中酪氨酸含量，单位为μg，A 为OD 值。

蛋白酶活力（U）以单位时间（min）内酶提取液样品产生酪氨酸的量（μg）表示。

使用蛋白定量测试盒并按照使用说明（考马斯亮蓝染色法），测定酶提取液样品蛋白浓度（mg/mL）。计算方法：酶提取液样品蛋白浓度（mg/mL）=（样品OD 值-空白OD 值）/（标准品OD 值-空白OD 值）×标准品浓度（5 mg/mL）

经计算可得，酶提取液样品蛋白浓度为0.968 mg/mL。

酶提取液样品的蛋白酶活力以单位毫克的蛋白质所具有的酶活力表示，称之为比活力，单位为（U/mg）。

解析：安装螺口灯座时，由于螺旋套是裸露的，人容易与它接触，故只能接在零线上才能保证安全；开关是控制电路通断的装置，在照明电路中，虽然不论是接在零线上还是火线上都能起到控制作用，但若接在了零线上，开关断开后，灯头里还会带电，是不安全的。

以时间（min）横坐标，比活力（U/mg）为纵坐标，绘制反应进程曲线。

1.3 温度和pH 值对酶活力影响的测定

在温度对酶活力影响的实验中，通过恒温培养箱控制酶反应温度为4、15、25 ℃，通过水浴锅控制反应温度为37、50、60 ℃。

在pH 值对酶活力影响的实验中，将反应温度设置为酶活力最高温度，实验pH 值设置为6.5～9.5，组距设置为0.5。使用磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配制pH值≤8.0 的缓冲液，使用碳酸钠和碳酸氢钠配制pH值≥8.5 的缓冲液。

按照福林-酚试剂法[7]测定不同条件下的样品的酶活力。

2 结果与分析

2.1 大西洋金黄水母胃丝蛋白酶反应进程曲线

由反应进程曲线（图1）可知，在15 min 内样品蛋白酶活力随时间线性增加，而15～20 min 内，样品蛋白酶活力增加的速度略有减缓，超过20 min 后酶活力增加幅度非常小，可能是由于反应物（酪蛋白）浓度下降等原因产生的。为了排除反应时间对酶活力的干扰，选定15 min 作为试验的酶反应时间。

图1 大西洋金黄水母胃丝蛋白酶反应进程曲线

2.2 反应温度对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活性的影响

由图2 可知，大西洋金黄水母胃丝蛋白酶的最适温度是50℃。试验结果表明，在4～60 ℃大西洋金黄水母胃丝中蛋白酶都具有活力，而且温度对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活力影响非常显著；在温度相对较低时（4～15 ℃），大西洋金黄水母胃丝蛋白酶维持在较低活力，其中10 ℃条件下蛋白酶活力相对4 ℃和15 ℃条件下的值略低；在25～50 ℃时蛋白酶活力急剧升高，在50 ℃时达到最高，随后又随温度提升而急速下降。

图2 不同温度条件对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活性的影响

2.3 不同pH 值对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活性的影响

由图3 可知，在pH 值6.5～9.5 条件下大西洋金黄水母胃丝蛋白酶均具有活性，且pH 值对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活力具有显著影响。pH 值为8.5 条件下蛋白酶具有最大的酶活力，即蛋白酶的最适pH值为8.5，之后酶活力向两侧递减，其中越接近最适pH 值递减幅度越大。

图3 不同pH 值对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活性的影响

3 结论与讨论

3.1 温度对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活力的影响

试验结果表明，大西洋金黄水母胃丝蛋白酶受温度变化影响非常显著，这与宋晶等[5]对海哲蛋白酶的研究结果一致。蛋白酶的主要组成成分是蛋白质，在低温情况下活力会变弱，随温度升高反应速度逐渐变快，而在过高的温度条件下，会发生蛋白质变性导致酶活力下降甚至完全没有活性。从试验结果可以看出，无论是低温4 ℃，还是高温50 ℃，均能监测到大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活性，说明水母对温度的适应范围很广。大西洋金黄水母从新英格兰南部海岸到热带地区均被发现过，表明其温度适应范围较宽，部分水母会在极端条件下生存下来，也与这一结果相吻合。

大西洋金黄水母胃丝蛋白酶的最适温度50 ℃高于饲养水温（22～24 ℃），与其他很多海洋生物有关的研究结论相似[8-10]。由日常饲养经验可知，当水温超过27 ℃时，水母会发生伞体畸形、回缩、游动速度变慢，甚至死亡，可能是温度过高导致机体蛋白质变性。因此，为了保持良好的形体以及较高的消化速率，应当维持饲养温度在24～25 ℃。

在胃丝蛋白酶的最适温度的比较上，相比于海蜇（42 ℃）[5]和海月水母（37 ℃）[6]，大西洋金黄水母 的最适温度明显较高（50 ℃），但是与海蜇的丝状附着器以及某些鱼类的胃蛋白酶[11]最适温度相接近，这表明大西洋金黄水母的胃丝蛋白酶组成成分与海月和海蜇有明显不同。虽然3 种水母胃丝蛋白酶的最适温度不同，但是它们在相对于温度的反应规律大体一致，即低温时蛋白酶活力较低，随温度的升高而逐渐升高，在最适温度达到最大随后迅速下降，有且仅有一个酶活力峰值。这表明，3 种水母胃丝蛋白酶均由几种理化性质相近的蛋白质组成。

3.2 pH 值对大西洋金黄水母胃丝蛋白酶活力的影响

在研究中，大西洋金黄水母胃丝蛋白酶在pH 值 6.5～9.5 条件下均具有较高的活性，与水母适应海水大范围pH 值的现象相吻合[12-13]。在最适温度50 ℃条件下，大西洋金黄水母在碱性条件下具有较高酶活力（8.0～9.0），由此可推测大西洋金黄水母消化酶中可能含有碱性蛋白酶。由于水母体腔与外界相通，大西洋金黄水母胃丝蛋白酶实际作用pH 值更接近海水pH 值8.0，略低于酶的最适pH 值。但是酶的最适pH值并不是一成不变的，而是受到温度、其他蛋白质等可溶性有机物大分子、缓冲液离子等多种因素影响。当反应液温度降低，蛋白酶的最适pH 值也会随之变 低[14-16]。试验的反应条件与实际条件有着明显差别，例如，饲养温度近似23 ℃，远低于试验温度50 ℃、以磷酸盐溶液为缓冲液等。因此，大西洋金黄水母饲养条件下的最适pH 值未必与蛋白酶的最适pH 值完全一致。

有研究表明，海蜇、沙海蜇以及僧帽水母的蛋白酶随pH 变化呈现出两个峰值[4-6]，表明它们均同时含有酸性和碱性蛋白酶。由于酸性pH 值条件下酶活力数据有限，暂时不能排除大西洋金黄水母胃丝中具有酸性蛋白酶，使其在较低pH 值条件下具有较高的酶活力。与多种水母的碱性蛋白酶最适pH 值相比，大西洋金黄水母的胃丝蛋白酶最接近海月水母（pH 值8.5），高于沙海蜇和僧帽水母（pH 值7.3～7.6），低于海蜇（pH 值9）[4-6]。这说明大西洋金黄水母可能具有与海月水母相同的碱性蛋白酶。