葛根素通过OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路介导对来曲唑引起骨流失的保护作用

韩俊 蒋现永 叶恒 陈东

武汉科技大学附属汉阳医院骨科，湖北 武汉 430050

芳香化酶抑制剂治疗是激素受体阳性(HR+)乳腺癌绝经后妇女的公认治疗方案[1]。来曲唑是一种非甾体芳香化酶抑制剂，是被批准用于患有HR+乳腺癌的绝经后妇女的三种药物之一。芳香化酶抑制剂可以阻断外周组织中雌激素的产生，从而将绝经后妇女体内循环中的雌激素水平降低到无法检测到的水平[2]。虽然雌激素抑制是治疗激素反应型早期乳腺癌的核心，但雌激素对维持骨密度(bone mineral density，BMD)也是必不可少的。雌激素水平降低，无论是由自然绝经还是医源性绝经引起的，都会导致骨转换增加和骨密度下降[3]。在芳香化酶抑制剂治疗期间，进一步抑制绝经后雌激素水平会加速骨转换、骨丢失和增加骨折发生率[4]。因此，早期使用抗骨质疏松症药物治疗预防骨量降低显得非常重要。葛根素是葛根叶提取物，是一种具有优良护骨作用的植物雌激素，其治疗骨质疏松症的疗效已被广泛报道。研究[5]发现喂饲含葛根素的饲料4周后，可抑制去卵巢小鼠股骨骨密度的下降。此外，葛根素还能预防去势雄性大鼠骨丢失[6]。葛根素对破骨细胞的抑制作用在其治疗骨丢失中占有重要地位。鉴于来曲唑常用于治疗绝经后女性，本研究目的是为了观察葛根素是否可以防治来曲唑对老年雌性大鼠骨骼的有害作用。

1 材料和方法

1.1 研究方案

30只老年(24月龄)雌性Sprague Dawley大鼠，体重为550～600 g。所有大鼠饲养在标准笼中，每笼4只，12∶12 h光暗循环，在(23±2)℃的舒适温度下饲养，并喂食正常的标准啮齿动物饲料，自由饮用自来水。30只老年雌性大鼠随机分为3组(n=10/组)，对照组(CON组)、来曲唑治疗组(LQC组)和葛根素联合来曲唑治疗组(GGS+LQC组)，每组10只。LQC组大鼠每周给予0.1 mg/kg来曲唑(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)灌胃治疗；GGS+LQC组大鼠给予葛根素[50 mg/(kg·d)；Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA]灌胃，并每周给予0.1 mg/kg曲唑灌胃治疗12周。

1.2 检测指标

采集血样两次。首先，在第0周从尾静脉取血，并在第12周后再次取血。在研究结束时对所有大鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺收集4 mL血液。将血液以3 500 r/min离心12 min，收集血浆并储存在-70 ℃直至进一步分析。使用ELISA试剂盒测定血清I型胶原羧基端肽β特殊序列(β-CTX)和I型前胶原N端前肽(P1NP)；CV灵敏度分别<8%和<10%。上述试剂盒均使用德国罗氏公司提供。

采用含有Inveon MM系统的Micro-CT扫描股骨干骺端。在体素为8.82 μm、电压80 kV、电流500μA、曝光时间1 500 ms的360个旋转步长中采集图像。用Inveon Research Workplace(西门子，慕尼黑，德国)计算参数如下：骨体积/总体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁间距(Tb.Sp)和骨密度。下颌骨感兴趣区在3个方向均位于生长线以下的股骨干骺端小梁内。每组随机选取5只大鼠，由3名独立评估员进行股骨干骺端骨形态计量学参数测量，一式三份。

治疗12周后，对大鼠进行安乐死，解剖出右股骨。使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)将股骨样品脱钙8周，将脱钙的骨样品包埋在石蜡中并使用Maason染色后用显微镜(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)检查组织切片。

随后对股骨进行蛋白印迹(western blot，WB)分析。用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，用BCA法测定其浓度。用10%SDS-PAGE分离出20 g蛋白，转移到PVDF膜上。膜随后在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h，并在4 ℃下与OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin抗体(1∶2500；CAT)一起孵育过夜。最后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体(1∶5000；CAT)孵育。编号7074；Cell Signal Technology，Inc.。37 ℃保温1 h。Image J2X软件版本2.1.4.7(Rawak Software，Inc.)用来测定蛋白质条带密度。每个实验一式三份，重复3次。

1.3 统计学分析

使用SPSS版本19.0进行统计分析。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s test比较不同组间的数据。P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 骨代谢指标比较

三组血清P1NP和CTX如表1所示，和CON组比较，LQC组的P1NP和CTX显著升高(P均<0.05)；而GGS+LQC组P1NP和CTX较LQC组明显降低(P均<0.05)；各组间血清P1NP和CTX差异有显著统计学意义(表1)。

表1 各组大鼠在实验结束时测量的骨标志物比较

2.2 Micro-CT检测结果

Micro-CT更好地显示了骨小梁的总体改变情况，股骨的微观参数如图1所示。LQC组左侧股骨干骺端骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th较CON组明显降低，而Tb.Sp较CON组明显升高(P<0.05)；而GGS+LQC组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th较LQC组明显升高，而Tb.Sp较LQC组明显降低(P<0.05)。

图1 各组大鼠股骨干骺端Micro-CT检测结果Fig.1 Results of micro-CT at the femoral metaphysis of three groups of rats注：a：CON组，b：LQC组，c：GGS+LQC组。与CON组相比，*P<0.05；与LQC组相比，#P<0.05。

2.3 老年大鼠组织学变化的影响

本研究表明，葛根素改善来曲唑对老年雌性大鼠的骨组织伤害作用。如图2所示，与LQC组相比，GGS+LQC组的大鼠骨小梁数量和密度得到明显的改善。

图2 各组大鼠股骨干骺端Masson切片检测结果 A：CON组，B：LQC组，C：GGS+LQC组(×40)。Fig.2 Results of Masson slices at the femoral metaphysis of three groups of rats. A: CON group, B: LQC group, C: GGS+LQCgroup (×40).

2.4 OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路改变

和CON组比较，LQC组的大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路的显著抑制，OPG、Wnt3α、β-catenin水平显著降低，RANKL水平明显升高，差异比较有统计学意义(P<0.05)。和LQC组比较，GGS+LQC组OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路明显激活，OPG、Wnt3α、β-catenin水平显著升高，RANKL水平明显降低，差异比较有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 使用WB检测OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin和β-actin的相对表达Fig.3 Relative expression of OPG, RANKL, Wnt3α, and β-catenin to β-actin using Western blotting注：与CON组相比，*P<0.05；与LQC组相比，#P<0.05。

3 讨论

雌性SD大鼠在出生后6～8周内达到成熟。研究表明，雌性大鼠在出生后的前3个月达到最大骨量。但随着年龄的增长，骨小梁质量逐渐减少。骨形成和骨吸收参数在第3～7个月迅速下降[7]。为了更好地反映老年女性骨代谢状态和骨骼特征，选取年龄对骨密度和骨转换指标的影响，本实验选用24月龄老年雌性大鼠，相当于70岁老年女性。本研究使用葛根素治疗观察其对来曲唑加重骨量流失和骨密度降低的影响。首先，老年雌性大鼠进行为期12周的治疗后，来曲唑能显著降低骨密度和股骨干骺端端骨小梁微观结构。其次，葛根素干预12周后，发现葛根素能显著改善来曲唑对老年雌性大鼠股骨远端骨小梁BMD和微观结构影响。第三，在葛根素治疗过程中，发现老年雌性大鼠OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路和骨代谢均发生明显改变。

本研究发现LQC组雌性大鼠BMD较CON组明显降低。另外，在葛根素联合来曲唑可以明显改善来曲唑对骨密度降低的影响，导致GGS+LQC组BMD明显升高。除了骨密度，骨保护的另一个重要评估指标是骨骼的形态参数，例如骨量和骨小梁厚度等[8]。本研究发现老年雌性大鼠股骨干骺端的骨小梁骨破裂，骨小梁变薄，骨小梁之间的间距变大。而来曲唑治疗后老年大鼠BV/TV、Tb.Th和Tb.N均显著降低，而Tb.Sp显著降低；葛根素干预治疗后可以显著增加骨小梁的数量以及之间连接，且明显优于LQC组。这表明葛根素可以显著保护来曲唑对老年雌性大鼠骨密度和骨量损害作用。

为了进一步评价治疗效果，在研究结束时对骨转换指标进行评估，分别测定血清P1NP和CTX水平作为骨形成和骨吸收的指标，CTX在LQC组明显高于其他组。而葛根素治疗后能使骨吸收指标(CTX)显著降低；结果证实激素缺乏可导致大鼠的骨量减少和骨吸收增加[9]。研究结束时，LQC组大鼠血清P1NP平均水平高于其他各组，这可能是由于老年雌性大鼠体内雌激素缺乏导致骨转换增加，而LQC干预后进一步影响所致[10-11]，导致血清P1NP升高。而葛根素治疗显著改善LQC对老年雌性大鼠骨代谢的影响，最终导致骨转换下降，出现P1NP和CTX水平明显降低。

Wnt/β-catenin活性的改变通常与发展性疾病和疾病(例如癌症、神经元疾病和骨骼疾病)有关[12]。越来越多的证据表明，Wnt/β-catenin信号传导途径参与了成骨和骨形成的调控[13]。OPG是TNF受体超家族的成员，在抑制破骨细胞分化，破骨细胞吸收功能和促进破骨细胞凋亡中起关键作用[14]。此外，先前的研究得出结论，葛根素的抗骨质疏松作用是由于通过上调OPG/RANKL的比例来抑制破骨细胞的产生[15]。由于OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路在骨量流失过程中起着重要的作用，本研究观察各组老年雌性大鼠治疗后OPG、RANKL、Wnt3α、β-catenin表达情况，结果表明来曲唑治疗组的OPG、Wnt3α和β-catenin表达明显降低，这表明来曲唑对骨组织有害作用可能通过抑制OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路激活来实现的；而在来曲唑治疗的基础上给予葛根素干预后骨密度和骨量得到明显改善，而OPG、Wnt3α和β-catenin表达明显升高，这表明葛根素可以通过激活OPG/RANKL及Wnt/β-catenin信号通路来促进骨形成，P1NP和CTX水平降低更好证实这一点。

总的来说，老年雌性大鼠在使用芳香化酶抑制剂出现明显的骨量和骨密度降低，使用葛根素治疗后可一定程度逆转来曲唑对骨骼有害作用。但是本研究选择研究对象特异性和数量有限，是否适合其他原因诱导的骨量流失还得进一步研究来验证。