三七黄芪颗粒中丹参素含量测定方法研究

湖南省衡阳市中医医院（421001）刘琪

健康元药业集团股份有限公司（518000）刘娟 曾菊香 成烨

近年来有关丹参素含量测定方法研究较少，尤其是制剂中丹参素的含量测定。本方法选用高效液相色谱法，通过参考文献[1][2][3]，对三七黄芪颗粒丹参素含量测定方法中的色谱条件、提取溶剂、提取时间、溶剂体积等进行考察，筛选最优方法，并对该方法进行分析方法验证。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪（配备二级阵列管检测器）、超声波清洗器、梅特勒-托利多XSE 205电子分析天平。

1.2 试剂和试药 丹参素钠对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110855-201614），三七黄芪颗粒（批号：20180501）、甲醇（分析纯、色谱纯）、乙酸（36%）、高纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：YMC Triart C18（4.6mm×250mm，5um）高效液相色谱柱；流动相：甲醇-1%乙酸（10∶90）；检测波长：280nm；进样量：10uL；理论塔板数按丹参素计应不低于3000。

1.3.2 丹参素对照品溶液的制备 精密称取丹参素钠对照品适量，加甲醇配制成0.1mg/mL的对照品储备液。精密移取对照品储备液加水配制成0.04mg/mL的溶液，即得。

1.3.3 供试品溶液的制备 取三七黄芪颗粒适量，研细，精密称取1.0g，至25mL棕色容量瓶中。加水适量使完全溶解，并定容至刻度，摇匀，用0.45um滤膜滤过，即得。

1.3.4 阴性溶液的制备 按产品配方除丹参以外的其他成分，按三七黄芪颗粒制得丹参阴性样品溶液。取阴性提取液2mL，按1.3.3供试品配制方法配制阴性溶液。

2 方法学考察[4]

2.1 专属性试验 分别取对照品溶液、丹参阴性样品溶液、供试品溶液按1.3.1项下色谱条件分别进行测定，记录色谱图。结果在供试品溶液色谱图中，存在于与丹参素钠对照品溶液色谱峰保留时间相同的色谱峰，且阴性溶液在相同保留时间位置未出现色谱峰，表明本方法专属性好，阴性样品没有干扰。供试品中，丹参素与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论板数按丹参素计符合要求。见附图。

附表 准确度（回收率）试验结果

附图 HPLC色谱图，A：对照品溶液；B：丹参阴性溶液；C：供试品溶液

2.2 精密度试验 精密吸取丹参素钠对照品溶液10uL，重复进样6次，记录峰面积。峰面积RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16h时，分别吸取10uL进样，测定峰面积。结果峰面积RSD为0.5%，表明供试品溶液在16小时内稳定，表明该方法的稳定性较好。

2.4 重复性试验 取同一批三七黄芪颗粒样品，精密称取5份，依上述方法测定丹参素含量，含量RSD为1.8%，表明本方法重复性良好。

2.5 线性考察 分别取精密吸取丹参素钠对照品溶液2μl、5μl、10μl、15μl、20μl（相当于丹参素0.0793μg、0.1984μg、0.3967μg、0.5951μg、0.7934μg）注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积A对含量C进行线性回归，得到回归方程y=750.96x+3.5891（r=0.999，n=5）。结果表明，丹参素在0.0793～0.7934ug范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.6 准确度（回收率）试验 精密称取已知含量的本品（批号：20180501，含量为149.2mg/100g）1.0g，加水适量使溶解，加入对照品储备液8mL，混匀，按“供试品溶液的制备方法”配制。同法操作6份，结果详见附表。

2.7 耐用性 分别选择不同色谱柱（①YMC Triart C18；②GL Sciences Inc. Inertsil ODS-3）、不同柱温（25℃、30℃、35℃），对丹参素的保留时间、分离度及理论板数进行考察。考察结果表明，不同色谱柱，不同柱温条件下，丹参素主峰的保留时间、分离度和理论板数有所差别，但均符合系统适用性要求。说明本方法耐用性较好。

2.8 含量测定 取3批供试品，按1.3.3方法操作制备供试品溶液，按1.3.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算供试品含量，结果批号20180501的含量为147.2mg/100g，批号20180502的含量为146.5mg/100g，批号20180502的含量为151.1mg/100g。

3 结论

本法用于测定三七黄芪颗粒中的丹参素钠，精密度高，准确度好，方法稳定，且良好的保留时间使丹参素与杂质彻底分离，达到分离度要求，测定结果可靠，可作为丹参素钠的含量测定的有效方法。

4 讨论

4.1 对照品溶液配制方法的考察 丹参素对照品溶液使用甲醇作为溶剂时，色谱峰会出现严重的前延使峰形不对称。而改用水配制后峰前延消失。但用水配制对照品溶液不利于保存，最终，丹参素对照品溶液采用二步稀释的方法，先用甲醇配制成对照品储备液，再用水稀释后进样。最终，峰前延现象得以解决。

4.2 流动相的选择 丹参素属于有机酸类，流动相中酸度的大小对丹参素的保留时间及峰形均有影响。本实验设计了甲醇-1%乙酸（10∶90）[1]、甲醇-0.2%冰醋酸（1∶5）[2]、甲醇-0.5%冰醋酸（16.7∶83.3）[3]进行考察。结果表明，甲醇-1%乙酸（10∶90）为流动相可将丹参素与其他组分分离，且峰形对称，保留时间合理，系统适用性均能达到要求。

4.3 提取溶剂的选择 丹参素的解离与酸度有关，而供试品中杂质的溶出量与甲醇的浓度有关，因此，分别考察以水、1%乙酸、甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1∶1）为供试品的提取溶剂，考察最佳提取溶剂。考察结果表明，杂质方面，水、1%乙酸杂质情况接近，最大峰高小于60；甲醇、50%甲醇、甲醇-1%乙酸（1∶1）杂质情况接近，最大峰高大约在150，各溶剂的杂质均不干扰丹参素的定量检测。含量方面，除使用甲醇作为溶剂处理的样品含量明显偏小外，其他各溶剂含量基本一致，基于环保无害的原则，选择水作为本方法的溶剂。

4.4 提取时间的选择 由于三七黄芪颗粒的制备过程添加了辅料，对主药进行赋形与稀释，因此可能对供试品的提取过程带来一定的影响。本实验对供试品的前处理采用超声的形式助溶，考察不超声、超声处理10min、20min、30min、40min对提取效果的影响。结果表明，供试品超声与否及超声时间长短对含量影响不大，说明供试品在水中能快速完全溶解，因此，供试品的处理过程不需要超声处理。

4.5 创新点 优化了丹参素钠对照品溶液的配制方法，解决了对照品溶液在进样过程中出现的前沿峰问题，提高检测准确性。且在本文研究中，采用了无毒无害的水作为提取溶剂，通过考证流动相的酸浓度，调整目标峰的保留时间，使之与相邻峰之间的分离度符合要求，为三七黄芪颗粒的质量控制提供很好的参考作用。