荧光定量聚合酶链反应联合拷贝数变异测序技术在产前诊断中的应用研究

李琴，魏兆莲，乔金平，陈薇，方慧琴，袁静

据统计全世界每年有500多万出生缺陷，我国每年出生缺陷儿100多万，占出生人口的5%。其中遗传因素占25%，在活产儿中染色体异常的发生率约为0.5%～1.0%；最常见的为13、18、21染色体和性染色体非整倍体异常[1-2]；环境因素约占10%；遗传和环境综合或病因未知占65%。目前因胚胎发育的复杂性及医疗技术的有限，对遗传因素目前研究的相对比较成熟，后两者尚不清楚。染色体疾病是指各种原因导致的染色体数目异常或结构异常；大多数染色体病胎儿在孕早期自然流产而被淘汰，部分染色体异常胎儿合并智力低下或（和）结构发育异常，目前尚无有效的治疗手段；阻止染色体异常胎儿出生是产前诊断工作的重中之重；因此提前产前诊断时间尤为重要。胎儿染色体异常中最常见的常染色体数目异常有：21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征；性染色体数目异常主要有XYY、XXX、XXY、45，XO等。染色体核型分析是染色体疾病诊断的金标准[3]，但传统的染色体核型分析技术只能检测染色体数目异常及大于5～10 Mb大片段染色体结构异常，不能检出异常的染色体小片段，分辨率较低，亦不能覆盖全基因组，难以判断异常染色体片段的来源和致病性。近年随着产前分子诊断遗传学技术的发展，荧光原位杂交（FISH）技术、荧光定量聚合酶链反应（QF-PCR）技术、染色体微阵列技术（CMA）、低深度全基因组拷贝数变异测序（CNV-Seq）等已逐渐成熟及广泛应用于临床，缓解了传统核型分析的压力；同时在深度上更详细地对染色体数目和结构进行分析，并能综合染色体微缺失微重复的片段位置、大小、来源及数据库和相关文献对其致病性进行评估[4]。本研究采用回顾性模式分析联合使用QFPCR和CNV-Seq技术对270例胎儿进行常见染色体非整倍体快速产前诊断和＞100 kb全基因组拷贝数变异结果与染色体核型从检出率、周期等方面进行比较分析，以利于需要进行产前诊断的孕妇可以有更多的选择，同时有助于此项技术在临床上推广和使用。

1 材料与方法

1.1 标本 在孕妇及家属充分知情选择并签署知情同意书后，对2019年7月—2020年5月就诊于安徽医科大学第一附属医院产前诊断中心的270例因产前血清学筛查异常或无创DNA筛查高风险孕妇人群进行羊膜腔穿刺术，抽取羊水8 mL中3 mL羊水用于QF-PCR检测，另5 mL羊水进行CNV-Seq检测。

1.2 QF-PCR检测

1.2.1 方法 选用13、18、21、X和Y染色体上共20对高度多态的短串联重复序列（STR）位点和一个性别基因（AMXY）进行多重扩增，再应用ABI 1300遗传分析仪（ABI公司）通过毛细管电泳检测判断是否存在染色体数目异常。严格按照说明书取DNA 20 ng进行PCR扩增，扩增结束后行毛细管电泳，GeneMapper software 4.0软件进行数据分析。

1.2.2 结果分析 根据英国临床生化协会、临床分子遗传协会（ACC/CMGS）规定异常峰型判读标准如下：三体患者的判断标准为①只有当每条染色体存在2个或2个以上的STR位点为异常峰型，才能诊断此样本为相应染色体异常；②任意一个STR位点出现3个等位基因峰（即峰面积比值接近1∶1∶1），或出现2个峰但是峰面积比值大于1.8或小于0.65的等位基因峰。45，XO诊断的标准必须具备：①所有X染色体STR位点呈单峰；②是将D13S305作为内参，D13S305峰面积与AMXY峰面积比在1.8～2.4之间[5]，见表1。

表1 5种染色体QF-PCR检测所用STR位点

1.3 CNV-Seq检测

1.3.1 方法 患者羊水标本进行离心沉淀取羊水中胎儿脱落细胞进行DNA提取，构建测序文库并进行质控，然后通过HiSeq2000测序平台进行CNV-Seq检测。

1.3.2 结果分析 将染色体全基因组测序检测到的基因组CNV参照国际基因组CNV 多态性数据库Decipher、UCSC Genome Browser、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）、International Standards for Cytogenomic Arrays（ISCA）等以及相关文献评估CNV结果是否有致病性，并附上相关文献。检测报告将严格按照美国医学遗传学会指南[6]进行CNVSeq分级，CNV-Seq结果有3个等级：致病性、致病性未知、多态性。

1.4 染色体核型分析 常规羊水中胎儿脱落细胞在本中心行传代培养胰酶消化法，制片G显带，参照ISCN（2009）标准进行染色体核型分析。

2 结果

2.1 QF-PCR与染色体核型结果比较 270例羊水标本进行QF-PCR检测后均在24 h后得出结果，染色体核型分析中有1例培养失败（后重新羊膜腔穿刺采集羊水标本）。结果显示21三体综合征12例，18三体综合征3例，XXY综合征2例，XYY综合征2例，检出率为7.03%（19/270），与染色体核型分析结果准确性一致。QF-PCR的检测结果准确快速且检测成功率100%。这270例羊水标本中未发现嵌合体，其中染色体核型中有11例为多态性（包括inv，pstk+，qh+，ps+），见表2。

表2 270例胎儿标本QF-PCR与传统核型结果

2.2 CNV检测结果 270例羊水标本均进行CNVSeq技术进行高通量DNA基因测序。CNV-Seq检测技术均在2周内出结果。其阳性结果总数为43例，阳性率15.9%（43/270）；其中19例为染色体非整倍体异常；另24例CNV-Seq提示染色体小片段微缺失微重复变异（其中明确致病CNV-Seq有9例，致病性未知CNV-Seq有5例，良性可能10例）；染色体多态性合并致病CNV-Seq 2例，多态性合并良性CNV-Seq有3例，另6例染色体多态性但CNV-Seq均正常。见表3。

2.3 CNV-Seq联合QF-PCR与核型技术检测周期及异常结果终止妊娠孕周比较 本研究中270例研究对象均进行了QF-PCR+CNV-Seq检测，最终结果异常选择终止妊娠共29例（包括19例染色体非整倍体异常、9例明确致病CNV-Seq和1例CNV-Seq致病未知合并超声提示合并尿道下裂）；QF-PCR+CNVSeq技术的检测周期比染色体核型技术快（1～2周vs.5周）、结果异常终止妊娠孕周早（20～23周 vs.23～28周）、所需标本量少（8 mL vs.20 mL），见表4。

2.4 随访结果 本研究中24例CNV-Seq结果中提示良性可能有10例；其中8例进行了双亲CNV验证，2例拒绝验证，本中心均进行了定期随访追踪，发现无论新发还是双亲遗传，目前已出生的10例暂未见异常表现。

3 讨论

3.1 临床上常见的染色体异常 染色体疾病是与遗传相关最常见的出生缺陷之一[7]。孕期检出染色体疾病患儿并及时干预是出生缺陷二级预防的关键。所有染色体异常发生概率不同，最常见非整倍体异常的染色体包括：21三体、18三体、13三体及性染色体异常[8]。染色体是基因的载体，染色体发生异常必然会存在基因重复或缺失，因此染色体异常通常表现为先天性智力低下、多发畸形、性发育不全、生长发育迟缓和早期反复流产等[9]；目前尚无有效治疗方法，唯一有效手段即是在孕期早发现、早处理。

3.2 产前诊断操作技术及检出方法 介入性产前诊断是降低染色体异常患儿出生缺陷的有效措施；此项技术包括经阴道绒毛穿刺、羊膜腔穿刺和经皮脐静脉穿刺术[10]，后两者技术在本中心开展比较娴熟，安全性较高；随着分子遗传学的发展，越来越多检测技术在临床上推广和使用。目前产前诊断染色体异常的检测技术主要包括[11]：一是细胞遗传学技术（即染色体核型分析）；二是快速诊断技术（rapid aneuploidy detection，RAD）技术，主要有FISH和QFPCR；三是分子诊断技术即CNV-Seq和CMA。由于任何一种检测技术都有其优势和局限性，面对众多的检测技术，如何兼顾检出率、准确性及经济卫生学效益选择合适的检测技术用于产前诊断临床应用，需要在产前诊断工作中不断地摸索和总结。

3.3 核型、QF-PCR和CNV-Seq三种检测技术利弊 目前诊断染色体疾病的金标准仍是染色体核型分析技术[11]。但核型分析方法要经过细胞培养，周期较长，一般需要10～15 d；培养过程中对操作人员要求较高，容易污染和培养失败，同时受限于分裂像的细胞数量和质量等要求；增加孕妇及其家属在等待染色体结果过程中的精神压力[12]。QF-PCR技术基于染色体STR应用于临床已二十多年，该技术以其快速、通量高、准确性高、特异性强、成本低、不需要细胞培养、所需标本量少等优点，迅速成为产前诊断的一项重要检测手段，但其仅局限13、18、21、性染色体非整倍体[13]。分子遗传技术如CNV-Seq采用高通量的下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）对样本DNA进行低深度全基因组测序，将测序结果与人类参考基因组碱基序列进行比对，通过生物信息分析以发现受检样本存在的CNV结果。CNV-Seq技术以高通量测序技术为基础，无需细胞培养，且不受探针种类及通量的限制，具有检测范围广、操作简便、通量高及成本低、兼容性好、所需DNA样本量少等优点，可检出＞100 kb全基因组拷贝数变异，分辨率较高，且可明确来源未知的异常染色体片段，对发现、鉴定疾病相关基因有重要意义和价值[14-15]，但其不能检出染色体易位、倒位和单亲二倍体等。

表3 270例胎儿标本CNV-Seq、QF-PCR和核型方法检测的异常结果比较 （N=43）

表4 CNV-Seq联合QF-PCR与核型技术检测周期及异常结果终止妊娠孕周比较

3.4 本研究中QF-PCR联合CNV-Seq技术与染色体核型分析比较 本中心综合考量，在原有传统核型基础上，采用QF-PCR联合CNV-Seq技术开展部分产前诊断工作。本研究发现3种检测方法因检测原理不同其检测周期长短不一，QF-PCR、CNV-Seq和染色体核型出结果时间（2 d vs.2周vs.5周）；由于3种技术检测范围存在差异性，本研究采用QF-PCR联合CNV-Seq技术在产前诊断工作中开展应用，不仅能快速准确诊断5种常见染色体非整倍体异常，同时结合CNV-Seq技术的低分辨率优势，解读染色体小片段拷贝数变异情况。贾峥等[15]已成功建立染色体拷贝数变异国家参考品，国内大多数试剂盒的性能及临床实验室质量均较稳定，在临床上普遍使用。本研究中QF-PCR技术检测成功率100%，均在2 d内得出结果，质控稳定，没有出现检测失败个例，成本较低，价格便宜，操作简单，重复性好，所需羊水量较少（3 mL左右）；核型分析由于1例血性羊水培养失败，需要再次采集标本，且由于核型对细胞数量有要求，故所需羊水量较多，达20 mL左右[16]。进行介入性产前诊断筛查的高风险孕妇群体在等待结果的过程中容易焦虑，这也是产前诊断工作中需要克服的问题。从来本中心进行羊水穿刺到异常报告并及时终止妊娠这段时间上分析比较，很明显QF-PCR联合CNV-Seq周期明显短于传统核型分析（1～2周vs.5周左右），缩短了孕妇焦虑的等待时间，实现早诊断早处理。从孕周上来分析QF-PCR联合CNV-Seq技术终止妊娠孕周一般在20～23周（第1次系统性产前诊断超声前），而核型分析技术终止妊娠孕周在23～28周左右。从社会经济效益上来看前者可减少不必要的检查和财力支出，节约了医疗资源。本研究中270例均进行了CNV-Seq检测，阳性结果有43例，阳性率可达15.9%（43/270），远高于核型阳性率7.03%（19/270）。核型结果中有11例提示染色体多态性，但已有文献报道染色体多态性在正常人群中普遍存在，是DNA高度重复，属于异染色质，无临床意义[17]。本研究11例染色体多态性中除了2例合并非整倍体异常，另有3例合并CNV-Seq良性可能，余6例CNV-Seq结果均正常；提示单纯染色体多态性和CNV-Seq良性结果并不对等，但其临床意义均不大[18]。本研究通过定期随访追踪，发现CNV提示良性变异胎儿和致病性不明变异胎儿，通过双亲验证，无论是新发还是遗传，在无合并结构异常的前提下，其出生后均未见明显异常，无明显差异。有研究表明核型分析未见异常但超声提示结构异常胎儿中，有6%～7%存在明确致病或可能致病的CNV[19]。核型分析与超声均未发现异常的胎儿中有1.0%～1.7%胎儿存在明确致病或可能致病的CNV[20]。因此CNV-Seq在产前检查非常重要。2019年4月《低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识》指出CNV-Seq技术可以弥补染色体核型分析的不足，可以检出亚染色体结构和数目异常，其深度可达750x，对于染色体病高风险胎儿，CNV-Seq技术可作为一线产前诊断方法[21]。尤其染色体核型正常，同时合并超声软指标异常等所谓不明原因或特发性产前诊断中，CNVSeq可对其风险评估提供更有力的理论参考。同时该共识在临床应用路线中提出在产前诊断工作时建议将QF-PCR与CNV-Seq技术联合应用[21]。

3.5 不足与展望 本研究收集的研究对象比较局限，仅局限在产前筛查高风险人群，同时本研究样本量较少。本中心将通过增大样本量进行大数据分析，且加强随访力度和延长随访时间。同时QF-PCR结合CNV-Seq技术有望在临床上不断扩大临床指征，尤其是孕周较大，涉及伦理学需求时，又不愿承担脐静脉穿刺术风险等情况可考虑选择羊水穿刺QFPCR联合CNV-Seq技术检测，实现胎儿常见染色体非整倍体快速诊断和全基因组拷贝数变异的分子遗传学诊断，为产前诊断和产后风险评估提供参考。