非高龄卵巢功能减退患者血清中抗核抗体、抗心磷脂抗体和抗β2糖蛋白1抗体的检测价值

张园，夏心如，蒋春艳，舒黎，吴畏，高彦，黄洁，冒韵东，刘嘉茵，马翔

卵巢功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢储备功能下降，表现为产生卵母细胞的能力和质量下降，伴有生育力低下，是体外受精/胞浆内单精子注射（IVF/ICSI）助孕的重要指征之一。近年来，DOR在接受IVF/ICSI助孕的不孕人群中的比例不断升高，接近10%～15%[1]。DOR患者表现为基础卵泡刺激素（bFSH）水平升高、抗苗勒管激素（AMH）水平下降、基础窦卵泡数（AFC）下降；在IVF/ICSI助孕过程中具有卵巢低反应、临床妊娠率下降、流产率增加等特点[2]。尽管促排卵方案不断优化、囊胚培养等技术不断改进，但DOR患者助孕后临床结局仍不够理想。众所周知，年龄是DOR发生的重要因素，高龄DOR患者被更多地关注。然而非高龄DOR患者生育需求迫切，是接受助孕的一类重要人群，近年来也越来越被关注。非高龄DOR患者在IVF助孕过程中仍存在卵巢反应低下、周期取消率高及流产率增加的不良结局[3]，但病因不明。因此，如何改善非高龄DOR患者的临床结局，特别是提高胚胎种植率、降低流产率，是目前生殖医学的讨论热点。近年来，免疫因素作为一种重要的DOR致病因素，已逐渐引起人们的重视[4-5]。有研究显示DOR患者存在免疫异常，特别是自身免疫异常，表现为自身免疫抗体水平增加[6]。然而相关研究存在一定的局限性，例如未排除年龄对DOR的影响、DOR筛查标准不够严格等。研究显示，胚胎种植失败可能和母体免疫紊乱相关[7]，这可能是胚胎种植失败、流产率升高的原因，对自身免疫抗体的筛查有助于早期发现这类生育力下降患者的免疫失稳状态。而对自身免疫抗体的筛查存在筛查成本高、特异度和敏感度不高等特点，筛查开展难度大。目前，抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）、 抗 心 磷 脂 抗 体（anticardiolipin antibody，aCL） 和抗β2 糖蛋白1 抗体 （anti-β2-glycoprotein 1 antibody，aβ2GP1） 被认为是生殖免疫的重要筛查指标，联合筛查成本可控，但与非高龄DOR关系尚不明确。因此，本研究通过联合检测并分析非高龄DOR患者血清中ANA、aCL和aβ2GP1这3项指标的阳性率，综合判断其对筛查非高龄DOR患者免疫状态的临床应用价值，为寻找非高龄DOR患者的免疫致病因素、改善非高龄DOR患者临床结局提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—2019年4月在南京医科大学第一附属医院（我院）生殖医学科接受IVF/ICSI助孕的127例非高龄DOR患者作为研究对象，即非高龄DOR组。所有患者均按照科室诊疗常规，经过病史询问、全身及妇科检查、超声检查、染色体核型分析以及内分泌等系统性检查后入组。纳入标准：①年龄≤35岁；②AMH≤1.1 ng/mL；③既往无自身免疫性疾病史；④3个月内无激素治疗史；⑤女方染色体核型正常。选取同期在我院生殖医学科单纯因男方因素（严重少弱精症、梗阻性无精症）行IVF/ICSI助孕的女性共82例作为对照组，排除女方患有自身免疫性疾病、染色体异常等。所有患者均签署知情同意书，本研究已获得我院伦理委员会许可。

1.2 方法

1.2.1 设备和试剂 实验设备主要包括荧光显微镜和分光光度计。试剂主要包括ANA检测试剂盒、aCL-IgG/IgM测定试剂盒和aβ2GP1检测试剂盒，均购自欧蒙医学诊断（中国）有限公司。

1.2.2 检测方法 2组研究对象均在IVF/ICSI进周期当月抽取外周血，采血后离心分离血清，分别检测血清中ANA、aCL和aβ2GP1水平。

1.2.2.1 ANA检测 应用间接免疫荧光法进行ANA谱的检测，利用ANA IgG检测试剂盒进行检测。用磷酸盐缓冲液（PBS）1∶100稀释待测样本，并将稀释后的生物样本25 μL加入生物载片反应区，室温孵育30 min。PBS冲洗载片后，用20 μL异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人二抗进行第2次孵育，室温孵育30 min清洗后封片。荧光显微镜下观察荧光颗粒及模型，并利用稀释倍数判断阳性的滴度值。

1.2.2.2 aCL-IgG/IgM和aβ2GP1检测 采用酶联免疫吸附法检测aCL和aβ2GP1。稀释液按1∶201对血清进行稀释，再往预包被板中依次加入标准品、质控品和待测样品，室温孵育30 min，洗板3次。每孔中加入100 μL抗人IgG/IgM辣根过氧化物酶（HRP）结合物，室温避光孵育30 min，洗板3次。每孔中加入100 μL色原/底物液，孵育15 min后，加入100 μL终止液终止反应。于波长450 nm处读取OD值，用折线拟合方式计算各样品浓度值。阳性判断标准：aCL-IgG≥20 U、aCL-IgM≥20 U，或aβ2GP1-IgG≥20 RU/mL定义为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。非正态分布的定量资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用秩和检验。定性资料用例数（百分比）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非高龄DOR组与对照组一般情况比较 2组患者的年龄、体质量指数（BMI）、基础黄体生成激素（bLH）、基础雌二醇（bE2）水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。而非高龄DOR组bFSH水平高于对照组，AMH水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

2.2 非高龄DOR组患者3项抗体的检测结果 将ANA、aCL、aβ2GP1 3项抗体作为联合筛查，统计2组患者3项抗体中至少1项抗体阳性的阳性率，非高龄DOR组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2组患者血清中ANA阳性率、aCL总阳性率、aCL-IgG阳性率和aCL-IgM阳性率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。非高龄DOR组血清中aβ2GP1阳性率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

DOR是指女性卵巢内正常卵泡闭锁过程加速或出生后卵子被不同机制破坏致使卵泡过早耗竭，剩余的卵母细胞数量较少或质量较低，从而导致生殖能力衰减的一种病理症状[8]。DOR病因复杂，目前研究认为主要包括年龄因素、遗传因素、免疫因素、感染因素、医源性因素等[9]，病因和发病机制尚不明确，非年龄因素相关的DOR患者尤其值得关注。

近年来，生殖免疫学的发展突飞猛进。越来越多的研究显示，生育力下降、胚胎丢失和反复种植失败可能与母体自身免疫紊乱密切相关[10]，常常伴有血清中一种或多种自身抗体表达异常。通过对自身抗体的筛查，可以及时、有效地反映机体失稳的免疫状态。其中，ANA、aCL和aβ2GP1等自身免疫抗体被认为和不孕不育症、复发性流产、反复种植失败以及一些妊娠期合并症的发生和远期结局密切相关，可作为筛查指标。既往研究显示，不明原因不孕患者ANA、aCL阳性率升高[11]，中重度子宫内膜异位症患者aβ2GP1阳性率升高[12]，推荐在接受助孕的高危人群中进行自身抗体的联合筛查。

近年来越来越多的学者关注自身免疫相关DOR，其中早发性卵巢功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）等可能存在交叉也可能处于不同发展阶段的卵巢功能异常，均被证实与自身免疫异常存在相关性[4-5]，合并自身免疫性疾病的概率也高于正常人群[13-14]。研究显示，约20%的POI患者合并至少一种自身免疫性疾病，最常见的是甲状腺和肾上腺的免疫性疾病，然而病因不明[13]。10%～30%的POF患者合并其他自身免疫性疾病，包括自身免疫性甲状腺炎、1型糖尿病、Addison病和系统性红斑狼疮（SLE）等[14]。Gleicher等[15]对38岁以下DOR患者（AMH＜1.5 ng/mL）进行病因筛查，结果显示37.8%的患者存在自身免疫异常。因此，对DOR患者进行血清抗体特别是自身免疫抗体的筛查值得临床关注。然而，目前关于非高龄DOR患者自身免疫异常的研究较少，缺乏非高龄DOR患者自身免疫状态筛查的有效指标。本研究将ANA、aCL、aβ2GP1 3项抗体作为联合筛查，结果显示24.41%的非高龄DOR患者至少存在1项自身免疫抗体阳性，符合DOR的发展规律。提示在DOR疾病发展早期对患者进行免疫病因筛查，可为非高龄DOR患者早期干预、改善后续助孕结局提供依据。

ANA是多种自身免疫性疾病的特征性抗体，是一组对细胞核内的核酸、细胞核蛋白和核糖体蛋白作为靶抗原的自身抗体的总称[16]。临床中，ANA可应用于SLE、混合性结缔组织病、干燥综合征等[17]自身免疫性疾病的筛查。除此之外，ANA还在生殖系统中发挥作用，被认为与复发性流产和反复种植失败等多种不良妊娠结局密切相关。研究显示，超过一半的复发性流产患者血清中ANA抗体阳性[18-19]，不明原因不孕患者中ANA阳性率约为14.8%[11]，约35.1%的反复种植失败患者也存在ANA表达水平增加[20]。POF患者中ANA抗体的检出率约为20%～40%[21]。Gleicher等[15]研究发现，约2.7%的38岁以下DOR患者ANA阳性。本研究结果显示，非高龄DOR患者ANA阳性率为3.15%，略高于对照组（1.22%），但差异无统计学意义。但本研究样本量较少，而且仅选择了ANA作为初步筛查，未进行ANA谱的系统检测，后续可以通过增加样本量、必要时进行ANA谱检测进一步筛查。

aCL是抗磷脂抗体的一种，也是抗磷脂抗体综合征的标志性抗体，其靶抗原是血小板和内皮细胞膜上带负电荷的心磷脂，常见于SLE及其他自身免疫性疾病。在生殖领域，aCL被认为与妊娠丢失有关，推测可能和血清中aCL增加继发性引起胎盘与蜕膜血管内微小血栓形成有关[22]。随着妊娠进展，aCL阳性患者胎盘功能异常会增加子痫前期的发生率，影响母婴安全[23]。研究显示，POF患者中aCL阳性率为10%～20%。卵巢局部血栓形成增加，减少卵巢供血，干扰卵细胞的正常生长发育，可能是DOR的原因之一[24]。国内小样本研究显示，DOR患者抗卵巢抗体（16/178）及aCL阳性率（15/178）较高，使用免疫抑制剂及阿司匹林可适当恢复患者卵巢功能，但研究并未排除年龄对DOR的影响[25]。此外，国外研究显示38岁以下DOR患者中约16.2%存在aCL阳性[15]，但研究并未设置对照组。本研究非高龄DOR组aCL总阳性率为8.66%，和对照组（6.10%）相比差异无统计学意义，推测aCL阳性与DOR的早期发病关联性不强，但值得进一步关注。

表1 2组患者一般情况比较 [M（P25，P75）]

表2 2组患者ANA、aCL和aβ2GP1抗体阳性率比较 [例（%）]

aβ2GP1也是一类抗磷脂抗体，是一种重要的抗磷脂抗体结合辅因子，其靶抗原为β2糖蛋白1（β2GP1，一种磷脂结合蛋白）。aβ2GP1可与多种细胞表面受体结合，包括内皮细胞、单核细胞、滋养层细胞和蜕膜细胞的表面受体以及凝血因子，介导细胞炎症反应、内皮细胞损伤、凝血功能异常等病理改变。因此，aβ2GP1可作为自身免疫性血栓的一种重要标志物[26]，可作为区分自身免疫性疾病和感染性疾病的血清学证据之一。近年来研究显示，aβ2GP1与IVF种植失败和复发性流产等不良生殖结局有关[27]。不明原因不孕的患者中约有10%存在aβ2GP1阳性[11]，16.3%的中重度子宫内膜异位症患者血清中aβ2GP1表达增加[12]。本研究结果显示，非高龄DOR患者aβ2GP1的总阳性率为15.75%，显著高于对照组（6.10%）。推测aβ2GP1阳性可能与DOR患者免疫失稳密切相关，其相关机制值得后续研究深入探讨。

研究表明，对自身免疫抗体阳性的不孕患者进行早期干预，有助于提高妊娠结局[28]。对ANA、aCL、aβ2GP1的阳性患者，在开展IVF/ICSI助孕前进行深入免疫病因追踪，必要时给予免疫调节剂和抗凝治疗，可显著提高这些人群的胚胎种植率和临床妊娠率[29]。是否可以对自身免疫抗体阳性的非高龄DOR患者早期进行免疫调节治疗，将有待于进一步深入研究随访，以期更好地阐明自身抗体阳性对非高龄DOR患者妊娠结局的影响，为非高龄DOR患者的临床治疗提供新的理论依据。

综上所述，非高龄DOR患者血清中aβ2GP1阳性率显著高于对照组，部分反映了非高龄DOR患者自身免疫异常的状态，推测可能是影响非高龄DOR患者后续IVF/ICSI助孕结局的重要因素之一。对非高龄DOR患者在IVF/ICSI助孕前推荐进行血清ANA、aCL和aβ2GP1的联合筛查，为揭示DOR免疫致病因素、改善DOR患者助孕结局提供临床依据。