三种野生蕨类植物抗肿瘤活性提取物的初步筛选

杨 俊，崔 婷，张 珏，刘 亮，梁光平*

(1.遵义医药高等专科学校 药学系，贵州 遵义 563006；2.贵州省野生药用植物 资源持续利用协同创新中心，贵州 遵义 563006)

恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康的主要问题之一，据统计数据显示，2015年我国恶性肿瘤患者约392.9万人，死亡约233.8万人，近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤带来的医疗花费超过2 200亿元[1-2]。在全球185个国家或地区中，中国的恶性肿瘤发病、死亡率位居中等偏上水平，部分消化道肿瘤，如食管癌、胃癌、肝癌等约占全球恶性肿瘤的一半，整体防治形势严峻[3]。蕨类植物是植物界的一大门类，长期以来各族人民就有药用和食用蕨类植物资源的习惯。本课题组前期报道披针新月蕨含有黄酮类、萜类、甾醇、糖及糖苷类、酚类、氨基酸、蛋白质、挥发油等化学成分[4]；粉背蕨含有黄酮类、糖及糖苷类、酚类、氨基酸、蛋白质、挥发油等化学成分[5]；荚囊蕨含有黄酮类、萜类、甾醇类、糖苷类、酚类、氨基酸、蛋白质、挥发油、内酯、香豆素等化学成分[6]。为深入挖掘野生蕨类植物在抗肿瘤方面的应用价值，本文对荚囊蕨、披针新月蕨、粉背蕨的抗肿瘤活性提取物进行了研究，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 药材及细胞株

三种野生蕨类植物均由贵州中医药大学药学院李继新老师提供，原植物经贵州中医药大学赵俊华老师分别鉴定为乌毛蕨科荚囊蕨属荚囊蕨(Struthiopteriseburnea(Christ) Ching)、金星蕨科新月蕨属披针新月蕨(Pronephriumpenangianum(Hook.) Holtt)、中国蕨科粉背蕨属粉背蕨(AleuritopterispseudofarinosaChing et S.K.Wu)的干燥全草，样本均存放于遵义医药高等专科学校药学系。

人肺腺癌细胞(A549)、人肝癌细胞(HepG2)、人胃腺癌细胞(BGC-823)、人乳腺癌细胞(MCF-7)四种细胞株由贵州省中科院天然产物化学重点实验室提供并完成活性筛选工作。

1.2 仪器与试剂

NAPCO Series 5400 CO2培养箱，SuPerMax 3100型多功能酶标仪，RV-3型旋转蒸发仪，PTT-FA200型天平，96孔培养板(美国Costar)。

胎牛血清(杭州四季青生物工程有限责任公司)；甲基噻唑蓝、二甲基亚砜(美国Sigma公司)；RPMI1640培养基；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均为市售分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 提取物的制备[7-8]

以荚囊蕨为例：取荚囊蕨全草粗粉50 g，置于圆底烧瓶中，加入300 mL石油醚(60～90 ℃)回流提取2.0 h，过滤，药渣继续加入200 mL石油醚(60～90 ℃)提取1.5 h后过滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪浓缩干燥得石油醚提取物(JNJ-SYM，2.8 g)。石油醚提取后的药渣经晾干处理，依次使用二氯甲烷(300 mL、200 mL)、乙酸乙酯(300 mL、200 mL)、正丁醇(300 mL、200 mL)作为溶剂，分别回流提取2.0 h、1.5 h，减压浓缩分别获得荚囊蕨的二氯甲烷提取物(JNJ-DCM，2.5 g)、乙酸乙酯提取物(JNJ-YZ，2.1 g)、正丁醇提取物(JNJ-ZDC，2.6 g)。剩下的药渣加水(300 mL、200 mL)煎煮即得荚囊蕨水提取物(JNJ-S，9.3 g)。

披针新月蕨参照上述方法，分别获得石油醚提取物(XYJ-SYM，1.9 g)、二氯甲烷提取物(XYJ-DCM，3.1 g)、乙酸乙酯提取物(XYJ-YZ，2.6 g)、正丁醇提取物(XYJ-ZDC，1.5 g)、水提取物(XYJ-S，7.1 g)。

粉背蕨参照上述方法，分别获得石油醚提取物(FBJ-SYM，1.4 g)、二氯甲烷提取物(FBJ-DCM，2.3 g)、乙酸乙酯提取物(FBJ-YZ，3.2 g)、正丁醇提取物(FBJ-ZDC，2.2 g)、水提取物(FBJ-S，8.5 g)。

2.2 活性检测方法

将各提取物分别配制成2、20、50 μg·mL-1三个浓度的溶液，参照文献[7-10]的方法，分别取对数生长期(细胞密度长到约80%～90%)的A549、MCF-7、HepG2、BGC-823细胞，采用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成5×104个·mL-1细胞悬液，接种在96孔板，每孔接100 μL，加100 μL培养基，培养24 h后，吸出培养液，加入新培养液180 μL及药液20 μL。培养72 h后，弃去上清液，每孔加入80 μL无血清培养基，20 μL的5 mg·mL-1MTT，37 ℃ 5% CO2培养4 h。取出96孔板，小心吸掉培养基上清。加入DMSO 150 μL，轻轻震荡10 min，使DMSO完全溶解MTT反应的产物，立即用酶标仪检测570 nm波长下的OD值。并按下式计算相应的抑制率(%)：

2.3 活性检测结果

采用MTT法分别检测荚囊蕨、披针新月蕨、粉背蕨的石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物在2、20、50 μg·mL-1浓度时对人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人胃腺癌细胞BGC-823增殖的结果，详见表1。

表1 三种野生蕨类植物提取物对A549、MCF-7、HepG2、BGC-823细胞的抑制作用

FBJ-YZ提取物在50 μg·mL-1浓度时，对A549细胞的抑制率为(15.64±2.21)%；JNJ-DCM提取物在各个质量浓度范围对A549细胞均具有一定的抑制作用，并且呈现出浓度依赖性；其余13个提取物对A549细胞几乎没有抑制作用。

对于MCF-7细胞，JNJ-DCM、JNJ-S、FBJ-DCM、FBJ-YZ提取物具有相对中等程度的抑制作用；XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC提取物在各个质量浓度范围对MCF-7细胞均表现出较佳的抑制作用，且呈现出浓度依赖性。杨娴[11]报道披针新月蕨的乙醇提取物在400、600、800 μg·mL-1浓度时对MCF-7表现出一定的抑制作用，在如此高的浓度下没有太大的应用价值，还未报道其他提取物，而我们得到XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC提取物在50 μg·mL-1时对MCF-7的抑制率分别能达到(45.78±3.87)%、(35.04±2.42)%、(37.92±1.52)%，说明抗肿瘤活性化合物主要存在于披针新月蕨的乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇提取物中。

FBJ-ZDC、FBJ-S、JNJ-YZ提取物对HepG2细胞具有一定的抑制作用，其余12个提取物对HepG2细胞几乎没有抑制作用。

JNJ-YZ、FBJ-YZ在各个质量浓度范围对BGC-823细胞表现出较好的抑制作用，且呈现出浓度依赖性，在50 μg·mL-1时抑制率分别为(39.17±7.75)%、(34.92±4.49)%，抑制率优于阳性对照药阿霉素在1×10-6mol·L-1浓度时的作用。XYJ-ZDC、XYJ-DCM、JNJ-ZDC、XYJ-YZ对BGC-823细胞具有中等程度的抑制作用，在50 μg·mL-1时抑制率分别为(20.77±1.34)%、(21.10±3.29)%、(23.93±4.86)%、(17.28±2.82)%。

3 讨论

贵州独特的气候条件和地形地貌非常适宜蕨类植物的生长繁殖，现有蕨类植物54科148属900多种，贵州的苗族等少数民族用蕨类植物治疗寄生虫、痢疾、风湿等病症，随着现代药学研究技术的发展，蕨类植物的作用机制逐渐阐明，成为开发新药材资源和研发新药的宝库。

笔者采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水五种溶剂对荚囊蕨、披针新月蕨、粉背蕨分别进行提取，得到3个系列共15种提取物，然后使用MTT法分别检测15种提取物在2、20、50 μg·mL-1浓度时对人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人胃腺癌细胞BGC-823增殖的影响。结果表明：XYJ-YZ、XYJ-DCM、XYJ-ZDC在50 μg·mL-1浓度时，对MCF-7的抑制率分别为(45.78±3.87)%、(35.04±2.42)%、(37.92±1.52)%；JNJ-YZ和FBJ-YZ在50 μg·mL-1浓度时对BGC-823细胞抑制率分别为(39.17±7.75)%、(34.92±4.49)%；其余提取物对上述4个细胞系的抑制作用较弱或无抑制作用，以上结果对于我们后期的进一步分离、活性筛选等工作具有重要的指导意义。