产S-腺苷蛋氨酸酵母菌的诱变选育

秦海彬，牛坤，王远山*

1(浙江工业大学，浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(生物转化与生物净化教育部工程研究中心(浙江工业大学)，浙江 杭州，310014)

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)存在于各种生物组织内，具有广泛的生物学功能[1]，参与体内蛋白质、核酸、多糖、磷脂以及脂肪酸等物质的生物合成[2-3]。SAM作为标准药物的替代品对治疗抑郁症、骨关节炎、酒精性肝病和阿尔兹海默病具有相当大的优势，市场需求巨大[4]。

SAM的生产方法主要有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法，其中化学法合成产率低，反应底物L-半胱氨酸价格昂贵，且分离与纯化过程困难，难以工业化应用[5]。酶促转化法需要SAM合成酶并添加价格昂贵的底物ATP，因其生产投入较高而缺乏市场竞争力。发酵法生产SAM具有工艺流程简单、产量高、底物廉价易得等优势而被广泛应用[6]。目前，已报道生产SAM的微生物主要有大肠杆菌(Escherichiacoli)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和酿酒酵母(Saccharomycescere isiae)。通过同源或异源过表达SAM合成酶可以提高大肠杆菌SAM产量，但是过多的SAM积累不利于菌体生长。重组毕赤酵母生产SAM需要甲醇作为诱导剂，可能引起安全问题，并且发酵周期长。与上述2种微生物相比，酿酒酵母作为安全生物广泛应用于食品与发酵行业，且SAM合成能力强，适宜作为SAM工业生产的菌株[7]。

在传统的产SAM菌株选育方面，SHIOZAKI等[8]筛选到1株野生酿酒酵母，在最适条件下通过发酵罐培养，SAM产量达到10.8 g/L，这是迄今在野生菌发酵产SAM方面最高的报道。利用化学诱变(NTG、EMS、LiCl等)、物理诱变(60Co γ-射线、U 等)以及复合诱变筛选SAM产菌株高也有较多报道，HUANG等[9]利用太空育种方法获得酿酒酵母突变株H5M147，SAM产量达到1.22 g/L，是原始菌株的1.87倍。CAO等[10]用紫外连续诱变结合乙硫氨酸抗性筛选的方法，得到SAM高活性合成酶的酿酒酵母CGMCC2842，与出发菌株相比SAM产量增加了2.7倍，同时在15 L发酵罐中分批补料发酵36 h后SAM产量达到6.1 g/L。为获得SAM高效生产菌株，本实验拟采用常温常压等离体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和137Cs γ-射线诱变结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板筛选，并通过摇瓶培养条件优化，5 L发酵罐分批补料发酵，为发酵法生产SAM奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要材料、试剂与仪器

Saccharomycescere isiaeZY由本实验室保藏。SAM标准品、乙硫氨酸、制霉菌素、生物素、泛酸钙、维生素B1、维生素B6,阿拉丁公司;其他试剂为国产分析纯。

ARTP-II型等离子体诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司；Waters 1525高效液相色谱，美国WATERS公司；spectraMax M5酶标仪，美国分子仪器公司；5 L BIOTECH发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然。固体培养基再加入20 g/L琼脂粉，115 ℃灭菌30 min。

摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 5，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，MgSO40.2，CaCl20.1，CuSO40.001 6，柠檬酸三钠二水合物 0.1，pH自然，115 ℃灭菌30 min。

发酵罐发酵培养基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 3，(NH4)2SO45，K2HPO45，KH2PO410， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.6，MgSO43，CaCl20.5，CuSO40.001 6，钼酸铵 0.004 8，NaCl 0.5，生物素 0.000 3，泛酸钙 0.003 6，维生素B1 0.003 6，维生素B6 0.003 6。115 ℃灭菌30 min。

发酵罐流加培养基(g/L)：葡萄糖 500，酵母粉12。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

(1)菌种活化及种子培养。取菌种甘油管涂布于固体培养基平板，30 ℃培养2～3 d，挑取单菌落接入装有10 mL种子培养基的试管中， 30 ℃，150 r/min培养12 h。活化结束后以2%的接种量接入装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，30 ℃，150 r/min培养12 h。

(2)摇瓶发酵培养。250 mL摇瓶中装液量为50 mL摇瓶发酵培养基，以4%(体积分数)的接种量接种，30 ℃，150 r/min摇床中培养24 h，补加2 mL 36 g/LL-蛋氨酸，继续培养24 h。

(3)5 L发酵罐补料发酵

发酵罐装液量为3 L，经过空消、实消灭菌后，种子培养基以10%(体积分数)接种到发酵罐中。控制温度、pH，罐压调控在0.05 MPa，以200 r/min的搅拌速度开始发酵，发酵全程通过控制搅拌转速与葡萄糖流加速度，使溶氧保持在10%～20%，最高转速为750 r/min。发酵过程中每隔2～3 h取样，测定还原糖、菌体量、SAM含量等参数。

1.2.2 诱变方法

(1)ARTP诱变。试验工作气体为氦气，工作气流量为8 SLM，处理距离为2 mm，电源输出功率为120 W。将培养6～8 h的菌体适当稀释后制备菌悬液，取5 μL菌液加5 μL 10%的甘油均匀涂于载片，80%～90%致死率剂量照射。照射后用无菌培养基清洗载片，洗液适当稀释涂布筛选平板上，30 ℃恒温培养箱中培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。

致死率/%=

(1)

(2)137Cs γ-射线诱变。在浙江省农业科学院辐照中心进行，将培养6～8 h的菌体适当稀释后制备菌悬液，80%～90%致死率剂量照射。照射后的菌液经适当稀释处理涂布筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。

1.2.3 突变株筛选方法

(1)ARTP诱变与乙硫氨酸抗性平板筛选。蛋氨酸在SAM合成酶与ATP的作用下转化为SAM，但在蛋氨酸类似物如乙硫氨酸的存在下该反应会被抑制，使用乙硫氨酸筛选高耐受突变株，有利于SAM产量的提高[11]。本实验将ARTP照射后的菌液适当稀释后涂布于0.4 mmol/L乙硫氨酸筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。

(2)137Cs γ-射线诱变与制霉菌素抗性平板筛选。SAM是酵母菌合成麦角固醇的主要甲基供体且消耗量大，而制霉菌素能够结合酵母菌细胞膜上的麦角固醇，导致麦角固醇产生途径缺失，细胞膜通透性改变。理论上，制霉菌素可以用来选育高产SAM菌株[12]。将γ-射线照射后的菌液进行适当稀释涂布于5 μg/mL制霉菌素筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。

1.2.4 测定方法

(1)生物量测定。菌体干重(dry cell weight，DCW)的测定：烘干至恒重的离心管称重(m1)，加入固定体积的发酵液，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，用蒸馏水清洗后离心，重复2次。然后85 ℃烘干至恒重后称重(m2)，m2-m1为菌体干重，经换算可得每升发酵液的菌体干重。

(2)SAM含量的测定。采用高效液相色谱法[13]。取1 mL发酵液，12 000 r/min高速离心2 min，弃上清液，加入200 μL超纯水，200 μL乙酸乙酯，30 ℃金属浴振荡30 min，随后加入500 μL 0.35 mol/L硫酸，振荡1.5 h后12 000 r/min离心2 min，取上清液，0.22 μm有机膜过滤待测。

液相测定条件：色谱柱J&K C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相为40 mmol/L 磷酸二氢铵，2 mmol/L庚烷磺酸钠和18%(体积分数)甲醇水溶液，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min,进样量10 μL，柱温30 ℃。

(3)葡萄糖含量测定。3,5-二硝基水杨酸法[4]。

2 结果与分析

2.1 高产菌株筛选

2.1.1 菌株ZY生长曲线与最佳照射剂量的确定

对酿酒酵母进行ARTP诱变时，一般使用对数生长中后期的菌体进行诱变，由于此时菌株酶活力高，生长旺盛且易发生突变[15]。每隔2 h取样测600 nm吸光值(OD600)绘制菌株ZY生长曲线。由图1可知，菌株对数期生长期在4～12 h，确定培养6～8 h的酵母细胞进行ARTP诱变与137Cs γ-射线诱变。经过照射时间和剂量的优化，发现ARTP照射180 s致死率在87.4%，由于诱变的致死率在80%～90%之间时，突变率相对较高，获得优良性能菌株的可能性最大[16]，故实验选择ARTP诱变照射时间为180 s。取ARTP照射后的优势菌株，进行γ-射线辐照，照射剂量700 GY时致死率在87%，故实验选择γ-射线诱变照射剂量为700 GY。

图1 ZY菌株摇瓶生长曲线Fig.1 Growth cur e of strain ZY in shake flask fermentation

2.1.2 ARTP诱变育种结果

ARTP照射菌株ZY 180 s，培养后涂布于乙硫氨酸筛选平板，挑选相对较大的单菌落进行摇瓶发酵培养。经过5轮诱变，共获得比出发菌株SAM产量高20% 的突变株23株。通过摇瓶复筛，突变株A-17的SAM产量最高，较出发菌株ZY提高了55.5%(表1)。因此，选择突变株A-17为进一步诱变的出发菌株。

表1 ARTP诱变复筛结果Table 1 The rescreening results of ARTP mutagenesis

2.1.3137Cs γ-射线诱变育种结果

突变株A-17经700 GY γ-射线照射4轮，共获得比出发菌株SAM产量高20% 的突变株11株。通过摇瓶复筛，突变株AC-4、AC-6和AC-10的SAM产量提升较高，其中突变株AC-10的SAM产量达到1.15 g/L，比突变株A-17提高了36.9%，比菌株ZY提高了130.0%(表2)。

表2 137Cs γ-射线诱变复筛结果Table 2 The rescreening results of 137Cs γ-mutagenesis

2.1.4 突变株遗传稳定性

为考察突变株传代后发酵水平稳定性，采用平板划线方法传代培养，将复筛的突变株AC-4、AC-6和AC-10各传代10次。挑取偶数代检测SAM含量，结果见图2。与突变株AC-4和AC-6相比，突变株AC-10的SAM产量较高且能稳定遗传，因此选作SAM的生产菌株。

图2 突变株AC-4、AC-6和AC-10遗传稳定性Fig.2 The inherit stability of mutant AC-4,AC-6 and AC-10

2.1.5 突变株AC-10摇瓶培养条件优化

2.1.5.1 培养温度的确定

考查了24、27、30、33和36 ℃对突变株AC-10生长和SAM产量的影响。由图3可知，温度对菌体量无显著影响，而对SAM产量有显著影响。30 ℃时菌体量和SAM产量都达到最大，分别为7.19 g/L和1.16 g/L，当温度继续升高，SAM产量则降低。综合SAM产量和菌体量，选择30 ℃为最适培养温度。

图3 温度对突变株AC-10生长和SAM生产的影响Fig.3 Effect of temperature on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.5.2 初始pH的确定

pH会对菌体细胞结构、参与代谢的各种酶活性力产生较大影响，间接影响菌体对培养基的利用，菌体的生长以及产物的生成[17]。在30 ℃下研究了不同初始pH值对突变株AC-10生长和SAM产量的影响。由图4可知，初始pH由4.5提高到7.5的过程中，SAM产量和生物量变化显著，且偏酸性环境有利于菌体生长和SAM生成，初始pH为5.5时菌体量及SAM产量达到最大值，分别为7.24 g/L和1.21 g/L。因此，选择初始pH 5.5为最适pH。

图4 初始pH对突变株AC-10生长和SAM生产的影响Fig.4 Effect of initial pH on growth and SAM titer of mutant AC-10

2.1.6 突变株AC-10 5 L发酵罐分批补料发酵

在5 L发酵罐中温度控制30 ℃，用氨水调节pH至5.5，以分批补料方式考查突变株AC-10产SAM的能力，其发酵曲线见图5。整个发酵过程可分为适应期、快速生长期和转化期3个阶段。发酵前期，菌株生长缓慢，糖耗低，培养至15 h葡萄糖基本耗完，溶氧迅速升高，此时开始流加培养基，起始流加速度10 mL/h，其中葡萄糖流加浓度约为2.5 g/(L·h)。15 h后菌株生长迅速，糖耗高，通过调节流加速度，使罐内残糖控制在5 g/L左右。配合转速与通气量调节，使溶氧保持在10%～20%。参考王杰鹏等[18]]蛋氨酸补加策略，当菌体量达到100 g/L时开始补加蛋氨酸。52 h时加入8 gL-蛋氨酸作为前体，此后每隔4 h补加一次。在L-蛋氨酸加入之前，胞内几乎没有SAM积累，在加入后则快速生成，在第68 h SAM产量达到5.62 g/L，最高产率为0.63 g/(L·h)。

图5 AC-10突变株5 L发酵罐分批补料发酵曲线Fig.5 Time course of fed-batch fermentation by mutant AC-10

突变株AC-10在菌体量和SAM产量方面比原始菌株均有所提高，摇瓶中SAM最高产量为1.21 g/L，经5 L发酵罐分批补料发酵，SAM产量可达5.62 g/L，与HUANG等[9]、CAO等[10]报道的SAM产量基本持平。突变株AC-10在52～62 h最高SAM产率为0.63 g/(L·h)，但62 h后生长明显停滞，原因可能是营养物质匮乏间接导致SAM产量降低。参考酿酒酵母发酵SAM的报道，如LI等[19]以突变株酿酿酒酵母CGMCC 13760利用豆腐黄浆液发酵SAM，在优化的工艺条件下，产量达到16.14 g/L;王杰鹏等[20]通过酿酒酵母SAM0801高密度发酵SAM，在优化的工艺条件下，SAM产量达到17.1 g/L;而LIU等[21]使用CRISPR工具整合外源基因获得重组酿酒酵母HDL-R2菌株，通过蛋氨酸补加策略优化，SAM产量达到10.3 g/L。因此，突变株AC-10仍有进一步发掘的潜力，后续可通过发酵工艺优化达到高密度发酵、蛋氨酸添加策略优化或遗传改造，进一步提高其SAM产量。

3 结论

针对S.cere isiaeZY发酵生产SAM产量低的问题，对其进行了5轮ARTP诱变和4轮137Csγ-射线辐照诱变，结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板筛选，获得1株遗传稳定性较好的突变株AC-10，其SAM产量为1.15 g/L，与出发菌株ZY相比提高了130.0%。通过摇瓶培养条件优化，确定最适条件为30 ℃、初始pH 5.5，经5 L发酵罐分批补料发酵68 h后SAM产量达到5.62 g/L。结果表明,ARTP与137Csγ-射线突变率高，易获得遗传稳定性良好突变株，结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性的理性化筛选育种，能够提高筛选效率。本研究可为发酵法生产SAM奠定基础。