ATP7B基因外显率降低的机制及对Wilson病诊断的影响

梁晨 郑素军

Wilson病(Wilson’s disease，WD)是由于编码铜转运蛋白的ATP7B基因发生变异、造成体内铜代谢紊乱的常染色体隐性遗传病。WD患者主要在5～35岁发病，临床表现以进行性肝损伤和神经系统障碍为主，严重时可导致急、慢性肝衰竭，甚至死亡。WD若能早诊早治，则预后良好，故诊断后主张立即开始治疗[1]。鉴于目前基因诊断在WD诊断中的重要性，了解ATP7B基因突变的外显率问题，有助于正确理解目前WD的基因诊断中存在的不足和缺陷，从而制定恰当的诊疗、随访措施[2-5]。本文就导致ATP7B基因外显率降低的相关机制，以及其对WD诊断的影响作一综述。

一、WD基因诊断存在的争议和挑战

基因测序技术无创、精准、特异性高。ATP7B基因突变检测已成为患者诊断及亲属筛查的一线方法[6]。通过基因筛查，WD患者的确诊时间平均可提前4年[3-4]。2012年欧洲肝病学会WD临床实践指南推荐的Leipzig评分系统[6]，是目前应用最广泛的诊断方法，该评分系统凸显了基因诊断的重要地位：当患者ATP7B基因存在2个致病性突变(复合杂合致病突变或纯合致病突变)时，按照Leipzig评分可得4分，即可诊断为WD。然而，在临床实践中，考虑到WD常常需要终身药物治疗，而青霉胺等药物常具有不同程度的毒副作用，对于无症状患者，是否仅凭借基因检测就可以确诊WD并立即启动临床治疗，尚存在不同声音，甚至造成一定的临床决策困惑，值得深入探讨[7-8]。

早期研究显示，世界范围内WD临床患病率为1/30 000，ATP7B基因杂合突变携带率却高达1/90。随后的流行病学研究发现，遗传上计算的患病率的确高于临床实际患病率。例如英国ATP7B杂合突变基因携带频率为1/25，预计携带2个致病性复合杂合突变频率为1∶7 026，其遗传患病率远高于1/30 000[9]。某些近亲结婚率低的国家，WD的临床患病率较低，如法国WD临床患病率为3/200 000，但ATP7B基因杂合突变携带率为1/31[10]。在世界范围内，东亚地区国家的WD临床患病率最高，为3/10 000，但韩国的ATP7B基因杂合突变携带频率却高达1/53[11, 12]。另外，近期有研究在排除人群和统计方法导致的差异后，对既往报道的致病性ATP7B基因突变的基因频率进行荟萃分析，利用哈迪-温伯格方程计算出全球WD的遗传患病率为1/7 194，远高于临床患病率7/50 000[11]。综上可知，世界范围内WD的遗传患病率远高于临床患病率。

既往曾有病例报道，对存在ATP7B基因c.3207C>A(p.H1069Q)纯合子突变的、具有严重神经系统症状的WD患者的亲属进行基因筛查，发现患者同胞中有1例存在p.H1069Q纯合突变，除KF环阳性外，虽然其未经任何系统治疗，直至84岁也未出现可能与WD相关的症状[8]。另外，还有研究发现，一个家族多个亲属存在相同基因突变而临床表型不同。该家族的先证者(31岁，男性)存在c.2129G>C(p.G710A)纯合突变，由于暴发性肝衰竭而接受了原位肝移植治疗。对该家族进行基因筛查后发现，其同胞(37岁，男性)存在相同突变，然而却无任何与WD相关的症状及阳性检查结果。15年后，先证者三代旁系亲属的下一代中出现1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.2128G>A(p.G710S)复合杂合突变的患者(16岁，女性)，因暴发性肝衰竭而进行了肝移植。进一步对该代其他成员进行基因筛查，发现1例存在c.2129G>C (p.G710A)/c.1607T>C(p.V536A)复合杂合突变、却无症状的同胞(16岁，男性)[5]。

由以上研究可知，在同一家族中无症状个体，即使其携带与WD先证者相同的纯合或复合杂合致病突变，也不一定影响铜转运蛋白的功能而导致体内铜代谢紊乱，也不一定会出现临床症状，故尚不能明确诊断为WD[5, 8]。实际上，其潜在原因是由于WD遗传患病率与临床患病率间存在明显差异。ATP7B基因外显率的降低目前被普遍认为是造成WD遗传患病率较临床患病率高的一种原因[5, 10]。

二、ATP7B基因外显率降低的机制

外显率是指具有特定基因型的个体，在特定的环境中表现出相应疾病临床症状的比例，常用百分数表示。如果这个比例等于100%，则该基因或基因型为完全外显率。反之，则为不完全外显率，即外显率降低。其多见于常染色体显性遗传病，但也可见于常染色体隐性遗传病。大型的人口/家庭流行病学及基因筛查被认为是测量外显率的必要手段。将1 000基因组项目(1 000 Genomes Project)测序结果(一般人群为主)与人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database, HGMD)进行比较，结合美国医学遗传学与基因组学学会(the American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)与分子病理学会(the Association for Molecular Pathology，AMP)共同修订的《序列变异分级标准指南》，发现健康的个体可以拥有大量的潜在致病变异，而不会表现出相应的临床症状。所以，外显率降低是人类遗传学中普遍存在的一种现象[5, 13-14]。总结造成ATP7B外显率降低的可能机制如下(图1)。

图1 ATP7B基因外显率降低的相关机制

(一)ATP7B突变位点及突变类型对外显率的影响 WD属于常染色体隐性遗传病，最常见的突变类型是错义突变，其次是移码突变、无义突变。错义突变分别占所有可能性致病变异的52%、突变等位基因频率的85%，其对外显率的影响往往小于移码、无义突变[11]；但也有例外，如目前在ATP7B信号肽区域发现的唯一的致病性错义突变p.N41S，可导致铜转运蛋白的错误定位，完全阻断铜的转运过程，使个体发病年龄较早。铜转运蛋白活性消失或降低，还受ATP7B基因突变位点的影响。欧洲WD患者中最常见的突变位点为p.H1069Q。p.H1069Q突变导致铜转运蛋白上高度保守的SEHPL结构域内、第1069位的氨基酸由组氨酸变成谷氨酰胺，从而影响铜在高尔基体上的跨膜转运。一项对荷兰WD患者p.H1069Q与临床表型间关系的研究中发现，p.H1069Q纯合或杂合突变的患者，比非p.H1069Q突变的患者发病更晚(平均年龄依次为20.9岁、15.9岁、12.6岁)。而且荟萃分析发现，p.H1069Q突变与Wilson疾病迟发有关,且纯合突变比杂合突变的影响更大[15]，其原因可能是此突变导致铜转运蛋白活性降低的程度小，对其功能影响小，导致体内具有潜在毒性的金属铜蓄积较慢。然而也有研究显示，即使突变发生在铜转运蛋白相同的结构域内，其功能结果也有很大差异。如位于ATP结构域的p.P840L与同一结构域内的p.I857T相比，前者对铜转运蛋白功能的影响更大[15]。综上，同一基因中突变位点不同，其外显率可能不同；在同一基因区域，某些特定突变位点也会影响外显率，且等位基因的数量也可影响外显率[13]。

(二)ATP7B基因单核苷酸多态性对外显率的影响 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指发生在一般人群基因组水平上的单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，变异频率大于1%，通常被认为是良性变异[13]。有研究报道，ATP7B基因中常见的SNPs位点，如p.K832和p.R952，并没有从根本上影响铜转运蛋白的功能，但可调节铜转运蛋白的化学性质和细胞内的铜稳态[16]。所以，在具有ATP7B致病突变的WD患者中，SNPs的存在可能会加剧致病突变的作用，从而影响WD的外显率。另一方面，虽然ATP7B SNPs对体内铜代谢过程的影响较小，但由于不同个体之间及环境差异等的影响，可能也会存在仅携带SNPs位点的WD患者[16-17]，即SNP表现出致病性。

(三)ATP7B基因调控因子、多种相关蛋白表达水平对外显率的影响 铜在体内的蓄积水平以及是否引起病理后果，也受ATP7B基因调控因子，和多种相关蛋白的表达水平的影响[18]。基因表达受顺式和反式调节因子的组合调控[13]。顺式作用元件本质上是一段DNA序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，存在于基因序列的上游或下游。反式调节因子是指能直接或间接地识别、结合顺式作用元件序列，参与调控靶基因转录的蛋白质。ATP7B基因表达的最终产物是铜转运蛋白[4]，因此顺式作用元件或反式调节因子的多态性可通过调控ATP7B基因的表达，来介导铜转运蛋白活性的高低，进而影响ATP7B基因的外显率。

另外，多种相关蛋白是否正常表达在调节ATP7B基因的外显率中也发挥着重要作用。例如，在胞质内传递铜离子到铜转运蛋白所必须的HAH1伴侣蛋白，肠道内可大量结合金属离子的金属硫蛋白，以及可以在细胞水平上对抗铜诱导的氧化应激能力的谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和热休克蛋白等[18-19]。

(四)修饰基因对ATP7B基因外显率的影响 WD患者ATP7B基因型-临床表型之间存在不完全一致现象，表明存在修饰基因。修饰基因是指本身具有或者不具有表型效应，和另一突变基因同时存在时会影响另一基因的表达程度的基因。这些修饰基因可影响个体对铜的耐受力或体内铜的储存能力。目前一些研究开始探索除ATP7B以外的突变基因对WD表型表达的作用[14]。

载脂蛋白e(ApoE)是中枢神经系统胆固醇和脂类转运的关键蛋白,也是肝脏的脂质转运蛋白之一。铜的细胞毒性作用是通过参与脂质过氧化反应、产生自由基导致细胞膜损伤来介导的。ApoE可以结合金属离子起到抗氧化作用，不同ApoE亚型对金属的亲和力不同，其中ApoE3对铜的亲和力最高。有研究发现，在相同的ATP7B基因遗传背景(纳入患者均为纯合p.H1069Q)下，不同的ApoE基因型是神经系统和肝脏症状延迟发生的重要因素之一[20]。其中，携带ApoEε3/3基因型的患者较其他基因型(ApoEε3/2，ApoEε3/4，ApoEε4/2)患者，出现神经系统和肝脏症状的时间明显晚、症状轻。故ApoE基因可通过抗氧化和保护细胞膜的完整性，延缓WD发生，且ApoEε3/3比其余基因型更有效。另外，ApoE4也被发现是阿尔茨海默症的危险因素，并可影响创伤性脑损伤造成的神经系统障碍的预后[20-22]。印度一项研究显示，与健康对照组相比，WD患者中ApoE4等位基因的比例明显升高，考虑ApoE4可能是WD发病的潜在风险因子，但该结果需要在更大的队列中进行验证[23]。

当ATP7B基因突变导致铜转运蛋白功能受损时，除上述ApoE基因外，由于一些其他调节铜代谢过程的基因(如MTHFR、COMMD1、ATOX1、HAH1等)的干预，可能会使WD患者的铜代谢参数正常，但目前它们在WD中的重要作用尚未完全明确[22, 24]。另外，Patatin样磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)主要参与甘油三酯代谢过程，PNPLA3突变最常见于非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者中，也被发现与WD患者中肝细胞、肝星状细胞中甘油三酯蓄积有关，故PNPLA3可能通过调节肝脏脂肪变性的严重程度，来影响ATP7B基因的外显率[4]。

(五)年龄、性别对ATP7B基因外显率的影响 既往报道显示多种遗传性疾病的外显率与患者年龄相关，WD也不例外[7]。一项迄今为止，纳入了最大WD患者队列的研究表明，年龄可有效地影响WD的临床表型[25]。通常，年龄<10岁的WD患者以肝脏症状为首发表现，而青春期和成年发病的WD患者多以神经系统障碍为首发症状。

遗传突变外显率与性别相关，可能是由于男女之间受差异基因的调控，特别是与性激素相关的基因[7]。雌激素可作为神经营养因子参与神经再生过程。另外，雌激素在慢性肝炎、肝纤维化、NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中的保护作用也在临床和基础实验研究中得到了证明[21]。在切除卵巢的WD大鼠模型中发现，性激素对WD大鼠的发病率无影响，但可影响其病程进展；另外，外源性睾酮可提高爆发型肝衰竭WD大鼠的存活率，外源性雌二醇可延迟WD大鼠的发病[26]。携带p. H1069Q纯合突变的荷兰WD患者中女性较多，其发病较晚，原因可能是由于雌激素的保护作用；但进一步对p. H1069Q基因型与性别间关系进行荟萃分析，未发现统计学意义[15]。也有研究发现，排除了暴发性WD和溶血性贫血的病例后，不同性别WD患者间肝脏表型无差异，但对于神经系统表现仍有统计学意义，其原因可能是雌激素对神经系统的保护作用[25]。

(六)环境、表观遗传修饰及其他因素对ATP7B基因外显率影响 除了上述因素外，环境、表观遗传修饰和多种代谢物等因素，似乎也在影响ATP7B基因外显率方面起着关键作用。日常饮食中铜和锌、酒精、感染、某些细菌的代谢产物(如大肠杆菌等)、可促进饮食中金属离子吸收的食品添加剂(如姜黄素等)等环境因素，可直接调节膳食铜的吸收，进而影响ATP7B基因外显率[5, 15, 25]。

对于遗传和环境背景相同的同卵双胞胎，其临床表型通常不完全相同，说明突变的不完全外显率是经常发生的，应该考虑表观遗传修饰(如DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑)的影响[19, 27]。排除后天的环境及表观遗传修饰的影响，同卵双胞胎突变外显率降低的原因还有多种不同的遗传学解释，如受精卵分裂后的突变、代偿性突变和体细胞拷贝数变异等。

三、总结与展望

目前，ATP7B基因检测是协助WD诊断的重要手段[1]。然而，研究显示，ATP7B基因外显率并不是100%。部分人群即使携带ATP7B纯合或复合杂合致病突变，体内也不一定存在铜代谢障碍，不见得发病。许多基因突变可能只是条件致病性的，只有当遗传和外部环境等上述因素间相互作用，使患者体内铜蓄积到某种概念上的阈值时，才会产生病理状态。因此，对于无症状WD患者，分子诊断仍具有挑战性，仅凭基因检测有时并不足以做出临床和治疗决策，尚需结合其他检查(如铜蓝蛋白、24小时尿铜定量、眼睛KF环、肝功能、肝组织铜定量、肝脏及头颅影像学等)来综合判断[5, 7]。部分仅检出存在纯合或复合杂合致病性突变、而无任何症状及体征的人群，经过全面评估，可以在患者充分知情同意的情况下，可暂不进行治疗，但应定期进行随访监测。

总之，目前ATP7B基因外显率降低的机制仍未完全阐明，仍需进一步研究。这也对目前常用Leipzig评分中、单凭基因检测(复合杂合突变或纯合突变4分)就做出WD诊断的可靠性，提出了新的挑战，有必要进一步完善这一诊断标准，相应的无症状WD患者的临床治疗及随访管理方案也需要进一步研究和制定。