肠道艰难梭菌定植对老年住院患者肝生化指标的影响

袁宝玉 武强 周聪 沈芳

肠道菌群是人体肠道内定植的种类多、数量大、功能复杂的微生物群体，在机体生理、病理过程中发挥重要作用[1]。目前肠道菌群是研究热点[2]，大量研究[1]表明，肠道菌群稳态失衡是影响多种疾病发生发展的关键因素，可以影响与肠道紧密相连的肝脏功能。目前证实肠道菌群失调和艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)关系密切，肠道菌群紊乱后导致艰难梭菌(Clostridiumdifficile, CD)过度繁殖并释放毒素[3]，发生CDI及相关腹泻，严重时可致伪膜性结肠炎，甚至死亡[4]。本研究对老年住院患者粪便标本进行CD相关检测，初步探讨肠道CD定植对老年人肝生化指标的影响。

资料与方法

一、材料来源

选取2019年4月-10月复旦大学附属上海市第五人民医院住院的老年患者187例作为研究对象，采集研究对象的粪便标本进行检测。入选标准：(1)年龄≥60岁；(2)标本收集时无明显腹泻症状，标本收集后72 h内未发生腹泻症状。排除标准：(1)先前有CDI病史者；(2)严重肝肾功能不全患者；(3)研究期间再次入院患者；(4)临床信息缺失患者；(5)入院48 h未排便患者。本研究获得医院伦理委员会批准。

二、仪器与试剂

肝生化指标分析，瑞士罗氏公司Cobas 8000仪器及配套试剂；肠道艰难梭菌CDIF选择性培养基，法国Bio Mérieux公司；艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒，美国 Abbott 公司；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析仪(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)，德国 Bruker Daltonics 公司。

三、方法

(一)研究对象临床信息采集 通过调取电子病历收集并整理患者的临床资料，主要包括年龄、性别等人口学特征以及血清丙氨酸氨基转移酶、总蛋白、白蛋白、胆红素等肝生化指标等。

(二)粪便标本厌氧培养及鉴定 规范采集患者粪便标本并及时送检。用无菌棉签挑取1 g粪便标本置于离心管中，加入等体积无水乙醇，混匀，离心去上清，取沉淀混合物接种到艰难梭菌CDIF选择性培养基上，37 ℃厌氧培养24～48 h，菌落呈灰黑色、扁平状，表面粗糙且带有平滑或不规则边缘，利用MALDI-TOF MS仪对可疑菌落进行鉴定，鉴定为CD阳性的菌株转种到血平板上，37 ℃厌氧培养48 h，进行纯化分离并保存菌株。

(三)免疫学检测谷氨酸脱氢酶抗原(Glutamate Dehydrogenase, GDH)、毒素A、毒素B

参考试剂盒说明书，挑取5个菌落至750 μL稀释液中，滴加1滴酶结合物，震荡，混匀；吸取500 μL混合物加入测试卡加样孔中，室温下孵育15 min；加入300 μL清洗缓冲液于反应窗口中，待其彻底吸收；最后滴加2滴底物于反应窗口中，10 min后读取并记录结果。反应窗口中同时显示两条蓝色线条记为产毒株。

四、统计分析

应用SPSS 22.0软件进行统计分析。计数资料以例数和百分比(n, %)表示，组间比较采用卡方或Fisher确切概率法检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、187例老年住院患者CD培养和毒素检测结果

本实验用CDIF选择性培养基对187份粪便样本进行CD分离培养，分离到疑似菌株共43株，经质谱分析仪鉴定35株为CD，纳入后续实验，阳性率为18.72%。免疫学检测GDH、毒素A、毒素B，GDH阳性率为100%，毒素阳性率为82.85%(29/35)。见图1。

二、187例老年住院患者肝生化指标检测结果

与CD非定植组比较，老年患者定植组肝生化指标白蛋白<35 g/L、前白蛋白<0.20 g/L、丙氨酸氨基转移酶>41 U/L 、天冬氨酸氨基转移酶>40 U/L、总胆汁酸>10 μmol/L、总胆红素>21 μmol/L、直接胆红素>5 μmol/L比例较高，差异有统计学意义(P<0.05)。两组比较总蛋白、球蛋白、γ-谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶差异无统计学意义(P>0.05)。

三、187例老年住院患者人口学特征情况

35例老年CD定植患者中，按照年龄分布，60～69岁有10人，70～79岁有12人，80～89岁有11人，90岁以上有2人，与非定植组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，老年住院患者CD定植率随年龄增大而升高。按照性别分布，男性17例，占48.57%，定植率为20.48%，较女性17.31%的定植率略高，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注：A：艰难梭菌阳性质谱图；B：艰难梭菌免疫学检测结果，其中上图为GDH+、毒素A+、毒素B+，中间为GDH+、毒素A-、毒素B-，下图为GDH-、毒素A-、毒素B-

表1 187例老年住院患者肝生化指标情况[n(%)]

表2 187例老年住院患者性别年龄分布

讨 论

老年人免疫功能降低，易患各类基础疾病，住院时间相对较长或反复入院，可导致肠道菌群生物多样性降低，增加感染风险[5]。根据美国流行病学研究，70%-80%CDI发生在65岁及以上老年人中[6]。老年人是CDI高危人群[7, 8]。但仅关注CDI患者不足以预防CD造成的院内感染，研究发现CDI患者可能仅占院内新增CDI病例的四分之一[9]。CD无症状携带者，可能是医院环境持续污染的根源，与CD传播及感染暴发密切相关[10, 11]，应加强对肠道CD定植老年患者的关注。

本研究对老年患者进行了初步研究，发现入院老年患者CD定植率为18.72%，略高于国外研究报道的4.4-15%[14]，产毒素菌株比例高(82.85%)，分析原因可能与患者年龄大、免疫功能下降、住院时间长有关。应当指出的是，入院时产毒CD定植患者发生CDI的风险几乎是非定植者的6倍[15]，且产毒CD定植患者可通过直接或间接接触传播到其他易感患者或环境中[16]。为防止医院CDI传播，建议尽早识别入院产毒CD定植患者并及时实施预防感染控制措施。

本研究将老年住院患者CD定植组与非定植组进行肝生化指标比较，观察到定植组丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆汁酸超出正常水平患者较多，总胆红素、直接胆红素(P<0.05)，提示CD定植患者肝细胞可能受到损伤，肝脏转化、排泄功能可能受影响。白蛋白、前白蛋白两个指标反映人体肝脏合成能力，是评估机体营养状态的常用指标，本研究结果显示定植组患者血清白蛋白、前白蛋白水平异常比例较高(P<0.05)，提示CD定植可能对老年人肝脏合成蛋白能力产生一定影响，CD定植老年患者营养状态相对较差，免疫功能降低，易引起感染[12]，加大CDI风险。

研究显示[13]，高龄是CD定植和感染的危险因素，本研究也有类似结果，随着老年住院患者年龄增大，定植率从12.82%、17.65%、28.95%增加到66.67%，分析原因可能与老年人机体免疫状态有关。

本研究对老年患者入院时CD定植情况进行研究，研究结果显示，CD定植率略高于国外报道，产毒CD比例较高，定植组肝肾功能指标异常比例高于非定植组。CD定植可能对老年患者肝功能造成一定影响，且定植患者发生CDI风险增加，加重临床治疗负担，提示医务人员应提高CD认识水平和检测能力，加强对年龄大、免疫功能低下且有基础疾病的老年人入院时CD筛查和监测，若发生不明原因腹泻，应及时明确是否发生CDI，从而早诊断、早治疗。