OSAHS患者外周血Th17细胞相关细胞因子的表达及临床意义*

章哪哪， 李本农， 许伟民， 李艳妮

武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属普爱医院耳鼻咽喉科，武汉 430034

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)是一种常见的慢性睡眠呼吸性疾病，由睡眠时反复上气道阻塞引起，可引发呼吸暂停和低通气。OSAHS在全世界范围内是一种高发病率疾病，在男性中发病率为34%，女性约为17%[1]。OSAHS患者在睡眠时可伴发巨大鼾声、慢性间歇性缺氧、反复出现微觉醒、睡眠结构紊乱等[2]。越来越多研究表明OSAHS引起的慢性间歇性缺氧能造成体内交感神经系统激活，氧化活性产物大量生成及慢性炎症因子产生[3]，这些细胞因子和炎症细胞的刺激导致体内一系列炎症反应，如嗜中性粒细胞募集、组织破坏、新生血管形成等，对人体各靶器官造成损害。已有研究显示如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-10等细胞因子在OSAHS患者中存在高表达[4]，经过治疗后，细胞因子引起的炎症反应减轻[5-7]。Th17细胞作为一种新型的T淋巴细胞，在机体的炎症反应、免疫应答、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生发展中具有重要意义，尤其在免疫应答及呼吸系统慢性炎症性疾病中起着重要的作用[8]，其核转录因子为RORγt，主要分泌IL-17、IL-6、IL-23等细胞因子。作为一种促进炎症及免疫调节的重要细胞，关于Th17在OSAHS中病理生理作用的研究尚少。本研究通过对不同严重程度OSAHS患者外周血中的Th17细胞及相关细胞因子进行系统研究，探讨Th17细胞及相关因子IL-17、IL-23、IL-6与OSAHS病情程度的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年1月至2018年12月在我科行多导睡眠监测(polysommogram，PSG)的患者，排除过敏性鼻炎、哮喘、风湿性关节炎及其他免疫性疾病，近4周内未服用抗组胺药、糖皮质激素等药物。研究资料包括患者的性别、年龄及体质量指数(BMI)、最低血氧饱和度、睡眠呼吸暂停低通气指数(apnea-hypopnea index，AHI)。本研究获得武汉市第四医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器

RORγt抗体(eBioscience，美国)，BCA试剂盒(Thermo Forma，美国)，IL-17、IL-23、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德)，酶标仪(Bio-Rad，美国)，美国邦德安佰S7000多道睡眠监测系统。

1.3 实验方法

1.3.1 AHI的测定 采用标准的PSG进行检测，并用睡眠软件进行睡眠分析。由专业技术人员依据美国睡眠医学会(AASM)发布的“睡眠及相关事件判读手册”[9]对睡眠软件分析后的结果进行判读，并计算出AHI，依据AHI值将患者分为对照组15例(AHI≤5次/h)、轻度组20例(5

1.3.2 标本的收集与处理 采集研究对象清晨静脉血6 mL，分2份，1份离心，取血清，用于酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞因子，1份肝素抗凝，1 h内用淋巴细胞分离液以Ficoll密度梯度法分离出外周血淋巴细胞，经含1%小牛血清的PBS洗涤后，制备淋巴细胞悬液，用于免疫印迹检测。

1.3.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) 取患者血清，按照IL-17、IL-23、IL-6的ELISA检测试剂盒说明书检测IL-17、IL-23、IL-6，通过A值计算相应浓度。

1.3.4 免疫印迹法(Western blot)检测核转录因子RORγt 吸出淋巴细胞悬液置于离心管中，PBS洗涤后加200 μL含蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上充分裂解40 min后，4℃、12000 r /min离心20 min；吸取上清，用BCA法测蛋白浓度，并调整浓度一致。100℃水浴5 min使蛋白变性后进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，洗涤3次后加入兔抗RORγt多克隆抗体(1∶2000)4℃孵育过夜，次日洗膜；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶5000)室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光法成像，扫描仪采集图像后用Image J图像分析软件对各图像灰度值进行半定量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

3组患者平均年龄、性别、BMI均无统计学差异，AHI及最低血氧饱和度比较均有统计学差异，具体见表1。

表1 研究对象一般情况比较Table 1 Comparison of clinical characteristics of participants

2.2 各组血清IL-17、IL-23、IL-6浓度

通过ELISA检测比较各组血清IL-17浓度，中重度组高于轻度组及对照组，各组间比较差异均有统计学意义(均P<0.01)；血清IL-23浓度，中重度组高于轻度组及对照组，各组间差异均有统计学意义(均P<0.01)；血清IL-6浓度，中重度组高于轻度组及对照组，各组间差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表2。

表2 各组血清中细胞因子水平比较Table 2 Comparison of cytokines in serum in each

2.3 RORγt蛋白表达情况

免疫印迹法检测显示，中重度组患者外周血淋巴细胞中Th17细胞核转录因子RORγt蛋白表达较轻度组及对照组高，三组间差异有统计学意义(F=169.86，P<0.01)，各组间比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图1。

与对照组比较，**P<0.01；与轻度组比较，△△P<0.01图1 免疫印迹法检测各组RORγt蛋白表达情况Fig.1 Detection of expression of RORγt protein in each group by Western blotting

2.4 AHI与血清Th17相关细胞因子及外周血淋巴细胞RORγt水平的相关性

通过相关性分析发现IL-17血清含量和AHI呈正相关(r=0.95，P<0.01)，IL-23含量和AHI呈正相关(r=0.87，P<0.01)，IL-6含量和AHI呈正相关(r=0.92，P<0.01)，RORγt蛋白表达量和AHI呈正相关(r=0.91，P<0.01)，见图2。

A：IL-17血清含量和AHI呈正相关；B：IL-23含量和AHI呈正相关；C：IL-6含量和AHI呈正相关；D：RORγt蛋白表达量和AHI呈正相关图2 IL-17、IL-6、IL-23、RORγt蛋白表达量和AHI的关系Fig.2 The correlation of IL-17，IL-6，IL-23，RORγt protein expression and AHI

3 讨论

慢性间断性缺氧是OSAHS的主要病理生理特点[10]，和缺血再灌注损伤有一定相似性[11]，由于长期的间歇性缺氧，OSAHS患者的高碳酸血症使中性粒细胞等炎性细胞应激性增多，相关炎症细胞因子浓度随之增加[10]。RORγt是Th17细胞分化和分泌IL-17A的关键核转录因子，可诱导Th0细胞分化成熟为Th17细胞，而IL-17、IL-6、IL-23是Th17细胞分化的主要细胞因子。本研究发现中重度OSAHS患者外周血淋巴细胞RORγt蛋白表达较轻度组及对照组高，中重度组血清IL-17、IL-6、IL-23等细胞因子较轻度组及对照组高，提示OSAHS程度越重，即慢性间歇性缺氧程度越重，Th17细胞分化增加，其分泌的相关细胞因子增加。这可能和OSAHS患者夜间缺氧达到一定程度时，造成缺氧诱导因子1(HIF-1)表达增加有关。有研究显示HIF-1能促使Th17分化增加[12]，也有研究认为间歇性低氧能诱导NF-κB活化[13]，产生更多的促炎因子如IL-6等，并抑制CD4+淋巴细胞向Treg细胞分化，联合TGF-β，通过Jak/STAT3信号诱导CD4+淋巴细胞细胞向Th17分化[14-15]。本研究显示细胞因子IL-6在中重度组较轻度组及对照组高，这和相关研究一致[16]，有研究认为缺氧引起的低氧血症和高碳酸血症能使交感神经兴奋，导致血中儿茶酚胺类物质的浓度升高，又进一步促进IL-6分泌，导致OSAHS患者血清IL-6水平的上升，IL-6既能在OSAHS的炎症中起着重要作用，也能促进Th17细胞分化[17]。Th17细胞分泌的IL-23是促进原始T细胞向Th17细胞分化的关键细胞因子[18]，已有报道IL-23在OSAHS中表达增加，但具体机制尚不清楚，可能和Th17细胞分化增加有关。

OSAHS诊断的金标准是PSG，AHI是评价其严重程度的指标[19]，本研究显示OSAHS患者外周血淋巴细胞RORγt蛋白含量、血清IL-17、IL-6、IL-23水平均和AHI呈正相关。国外也有研究显示某些血清学指标如CRP、IL-6和OSAHS严重程度呈相关性[20]，因此试图将其作为评价OSAHS严重程度的一种补充检测。有研究认为在越严重的间歇性低氧环境中，研究对象的炎症反应更严重[14]，而Th17细胞作为重要的促炎细胞，其细胞数量及分泌的细胞因子因此增加，这些炎性因子水平显著升高可能是诱发和加重OSAHS的重要调控机制之一。但由于本研究样本量的限制，Th17细胞及其细胞因子水平能否作为评价OSAHS严重程度的指标，还有待进一步研究。同时尚需密切随访经长期持续正压通气治疗后的OSAHS患者，以其体内Th17细胞及相关炎症因子的变化情况作横断面研究。

综上所述，OSAHS是一种慢性炎症性疾病，Th17细胞及其细胞因子介导的炎性反应可能在OSAHS的病理生理过程中起着重要的作用，且与OSAHS的严重程度有关。阻断这些细胞因子，可望成为减少OSAHS病理损伤的新途径。