彩色超声联合血浆miR-191、miR-21测定对上皮性卵巢癌的诊断效能

张琳琳，黄仲萍，陈樑，陈玉

卵巢癌是指发生于卵巢的女性恶性肿瘤，其中约90%肿瘤来源于上皮，即上皮性卵巢癌(EOC)[1]。早期EOC难以发现，发现时多为晚期卵巢癌，预后极差[2]。流行病学研究显示[3]，早期EOC 5年生存率高达90%，而晚期仅为20%～30%，患者生活质量严重降低。目前临床以病理活检为诊断金标准，但其技术要求高，依从性低[4]。彩色超声在临床筛查盆腔肿块等具有重要的作用，其可在检查卵巢组织、细胞血流变化的同时检测卵巢的大小和形态变化等，进而诊断EOC，但其诊断方式有一定的局限性，需综合受检者体型、腹壁厚薄、肿块深浅及膀胱充盈程度等因素[5]。微小RNA(miRNA)在肿瘤细胞的生长、增殖、转移及凋亡等方面具有重要的作用，且miR-191和miR-21在EOC中异常表达，其有望成为诊断EOC的新型血浆学指标[6-7]。为弥补单一方式诊断效能不足，现研究彩色超声联合血浆miR-191、miR-21测定对上皮性卵巢癌的诊断效能，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月—2020年2月四川省绵竹市人民医院妇科收治EOC患者60例作为卵巢癌组，另外选取同期在医院治疗的上皮卵巢良性肿瘤患者60例为良性组，健康体检者60例为健康对照组。卵巢癌组年龄44～60(52.10±2.86)岁，体质量指数(BMI)16.00～28.14 (22.07±2.35)kg/m2；临床分期以国际妇产科联盟(FIGO)分期为标准[8]，Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期23例，Ⅳ期2例；病理类型：浆液性癌36例，透明细胞癌15例，黏液性癌9例。良性组年龄44～60(51.87±2.91)岁；BMI 16.27～28.09(22.18±2.29)kg/m2。健康对照组年龄44～60(52.05±2.89)岁；BMI 16.15～27.81(21.98±2.26)kg/m2。3组受试者年龄及BMI等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：经病理组织活检确诊为EOC[9]；未经过卵巢癌手术治疗、化疗及放疗等系统治疗；近1个月内未服用激素或避孕类药物；可正常沟通交流者。(2)排除标准：并发自身免疫疾病、严重感染及重大手术创伤者；并发其他恶性肿瘤者；妊娠期或哺乳期患者；毒品或酒精滥用者；不配合研究者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 彩色超声检查：应用美国GE Voluson E10四维彩色超声仪，受检者平卧于检测床，检测时先行腹部彩色超声检测，探头频率为3.5 MHz，对肿块或包块直径不足5 cm或未能识别的包块，需行阴道彩色超声检测，探头频率为5～7 MHz，密切观察肿瘤壁位置、分隔、回声及血流状况等影像学特征，以确定肿瘤包块良性或恶性。

1.3.2 血浆miR-191和miR-21表达水平检测：于受试者入组时采集空腹外周静脉血4 ml，于4 ℃ 离心后将上清(血浆)分装到1.5 ml的离心管(离心管经无RNA酶处理)中。再次于4 ℃离心去除残余细胞，将上清转入新的离心管中，即得所需血浆，-20℃温度条件下保存备用，应用实时定量PCR法测定血浆miR-191和miR-21。手术过程中取出新鲜的上皮性卵巢癌组织标本50 mg，用研棒碾碎后应用美国invitrogen公司生产的Trizol试剂提取EOC组织总RNA，同时使用NanoDrop one超微量紫外分光光度计测量RNA浓度，波长选择260 nm和280 nm，吸光度比值 1.8～2.0，将RNA逆转录后行PCR检测法。引物具体序列如下，miR-191上游引物：5’- ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’，下游引物：5’- CGGGGTACCATCAGAGTGGCCCCGATAAAGTA-3’；miR-21上游引物：5’-GCGGTAGCTTATCAGACTGA -3’,下游引物：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC -3’；U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，采用CFX384Touch型号定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)行PCR反应，扩增条件： 95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、20 s和72℃、30 s，扩增循环40次后行熔解曲线相关分析，每组数据各测定3次，取平均值。miR-191和miR-21表达均以U6为参数值，得到△Ct值，2-△△Ct即为miR-191和miR-21的相对值。血浆肿瘤指标诊断标准根据ROC曲线最佳临界值，高于临界值则判定为阳性。

2 结 果

2.1 卵巢癌组和良性组彩色超声结果比较 卵巢癌组和良性组病变直径比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在质地、形状、位置及包膜完整度等方面比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 卵巢癌组和良性组彩色超声影像学结果比较 [例(%)]

2.2 3组血浆miR-191和miR-21表达水平比较 血浆miR-191和miR-21表达水平比较，卵巢癌组>良性组>健康对照组(P均<0.01)， 见表2。

表2 3组血浆miR-191和miR-21表达水平比较

2.3 卵巢癌组不同肿瘤分期血浆miR-191和miR-21表达水平比较 卵巢癌组血浆miR-191和miR-21表达水平随着肿瘤分期提高而增加 (P均<0.05)， 见表3。

表3 卵巢癌组不同肿瘤分期血浆miR-191和miR-21表达水平比较

2.4 各指标对卵巢癌诊断价值的ROC曲线分析 ROC曲线分析结果表明，彩色超声诊断EOC的AUC为0.748(95%CI0.687～0.808)；血浆miR-191 截断值为1.67，AUC为0.595(95%CI0.519～0.671)；血浆miR-21 截断值为1.55，AUC为0.703(95%CI0.632～0.773)；在最佳临界切点时，三项联合检测的AUC为0.848(95%CI0.801～0.895) 。联合检测诊断EOC的效能高于各指标单独检测(P<0.05)，见图1、表4。

图1 彩色超声、miR-191与miR-21单项检测及

表4 彩色超声、miR-191和miR-21单项检测及联合检测诊断EOC效能分析

3 讨 论

EOC是女性常见的恶性肿瘤，具有隐匿性强、转移侵袭性高及预后差等特征，早期临床症状不显著，而中晚期会出现腹部剧烈疼痛、胃肠道紊乱、腹腔积液、乏力和消瘦，甚至发生颅内转移，严重威胁患者生命安全[10]。EOC病因较为复杂，主要与遗传、激素分泌异常及性生活紊乱等相关[11]。随着医学技术的进步和发展，临床医师和学者对EOC疾病的诊断和评估进行深层次探讨，常见的EOC诊断方式为影像学、病理活检和血浆学指标[12]，其中病理检测专业度高、价格昂贵、有创伤，影像学侵入性低、检测方便、费用低廉，而血浆肿瘤标志物为诊断选择的热点。为避免影像学的局限性，并弥补单一指标诊断效能不足，本研究将彩色超声、血浆miR-191和miR-21联合检测，并应用ROC曲线评估其单独和联合检测的诊断效能，旨在为临床研究提供依据。

彩色超声是女性妇科疾病诊疗的常见方式，其不仅可测量腹部肿块直径，而且还可观察肿瘤形态、包膜完整度、腹水及壁厚等影像学特征，并根据肿块的质地、包膜及边界等特异性特征区分肿块性质[13]。研究表明[14]，良性瘤块呈膨胀生长趋势，质地均匀，囊肿分隔，囊壁厚薄一致，以完整包膜和囊性回声为主，同时肿块后面伴有增强回声效应；卵巢癌等恶性肿瘤为侵袭性生长形态，肿块及其边界不规则，囊壁粗糙，且后方声影信号降低，并伴有腹水。本研究中，彩色超声检查结果显示，卵巢癌组和良性组肿物直径比较差异无统计学意义(P>0.05)，而在质地、形状、位置及包膜完整度等方面比较差异有统计学意义(P<0.05)，与文献研究相符；同时ROC曲线分析结果显示，彩色超声敏感度为68.33%，特异度为70.00%，AUC为0.748(95%CI0.687～0.808)，与朱晓玲等[15]敏感度76.40%和特异度76.47%的研究结果相近，单独彩色超声技术诊断效能较低，分析认为，彩色超声检测时易受肠道气体、肿块大小、膀胱充盈及肥胖程度等因素干扰而造成误诊或漏诊等现象，因而需联合其他检测手段，以提高EOC阳性检出率[16]。

MiRNAs是一类长度为18～24个核苷酸的内源性非编码小分子单链RNA，对约30%人类蛋白的表达具有调节作用，可通过特异性匹配而干扰mRNA的正常转录、翻译过程，进而发挥调控靶基因的功能。研究表明[17]，miRNAs可在调节原癌和抑癌基因的基础上介导新生血管生成、免疫功能逃逸及细胞转移等途径，进而促进癌症的发生进程。同时，miRNA在外周血中稳定存在，并可抵制强酸、强碱及反复冻融等恶劣保存条件，可成为潜在的肿瘤标志物。已有多篇文献报道，miR-191和miR-21与多种类型恶性肿瘤的发生、发展相关，二者在胃癌、肺癌及肝癌等癌症中发挥重要作用，高桂卿等[18]研究证实，miR-191在卵巢癌患者中呈异常升高状态，可应用于EOC的临床诊断；而郝文涛等[19]研究60例卵巢癌患者结果表明，EOC组患者血浆miR-21明显高于良性组和健康对照组，且与临床分期和组织分化有相关性。本研究结果显示，3组受试者血浆miR-191和miR-21水平差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢癌组和良性组血浆miR-191和miR-21明显高于健康对照组(P<0.05)，且卵巢癌组明显高于良性组(P<0.05)，证实miR-191和miR-21在EOC诊断中的重要价值。进一步比较二者诊断效能，发现血浆miR-191诊断的临界值为1.67，其敏感度为61.67%，特异度为58.33%，而高桂卿等[18]研究表明，miR-191诊断EOC敏感度为84.7%和特异度83.0%，显著高于本结果，可能与样本量、样本来源有关，同时miR-191可在胃癌、肝细胞癌等中异常表达，单一诊断EOC效能较低。血浆miR-21诊断的临界值为1.55，其敏感度为65.00%，特异度为65.00%，其高表达与临床分期、淋巴结转移等病理特征相关，与曾玉等[20]研究的敏感度68.33%和特异度78.57%相近。

结合单一诊断分析结果，本研究进一步对彩色超声联合miR-191和miR-21的诊断效能进行评价，其敏感度和特异度分别为80.00%和58.33%。相较于单一彩色超声技术，敏感度由68.33%提高到80.00%，较好的弥补了彩色超声诊断的漏诊率。另外，联合诊断AUC为0.848，明显高于影像学单独诊断的0.748，miR-191诊断的0.595和miR-21诊断的0.703，结果显示，联合检测能在显著提高诊断敏感度的基础上保持较高的特异度和准确度，血浆肿瘤标志物miR-191和miR-21在一定程度上弥补了影像学不典型而导致的漏诊，从彩色超声及血浆标志物等多方面进行综合诊断，以提高诊断效能。

综上所述，彩色超声联合血浆miR-191和miR-21，可有效提高上皮性卵巢癌诊断的敏感度，并保持较高的特异度和准确度，可弥补影像学的局限性，为早期诊断提供思路。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张琳琳：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；黄仲萍：提出研究思路，分析试验数据，论文审核;陈樑、陈玉：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改，进行统计学分析，课题设计，论文撰写