扩展青霉和展青霉素的生物防治研究进展

胡倩珏，乔楠桢，于雷雷，翟齐啸，田丰伟，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

水果作为人体膳食结构的重要组成，因具有延缓衰老、降低胆固醇和预防心血管疾病等保健功效而深受消费者喜爱。由病原菌侵染造成的腐烂是水果采后的主要问题。扩展青霉是一种多细胞的丝状真菌， 也是导致果实采后青霉病的主要致病菌，几乎在所有腐烂的水果中都可以分离得到。它不仅会引起水果由外到内的腐烂，造成巨大的经济损失，而且在侵染的过程中会分泌真菌毒素——展青霉素[1]。展青霉素残留在受污染的水果及其衍生制品中，会对人体健康造成危害，并引发严重的食品安全问题。目前，主要利用物理方法和化学方法来控制水果采后病害。物理方法能够在不同程度上抑制病原菌活性和毒素积累，但由于设备成本昂贵和工业化难度大，且处理不当的话可能会使水果的理化性质和感官品质发生改变，在实际应用上存在很大的局限性。化学杀菌剂虽效果显著，但随着科学的发展，发现长期使用会引起环境污染和产生病原菌耐药性问题，其潜在的安全隐患使它们的使用范围受到越来越严格的限制。因此，寻求安全高效的抑菌物质控制水果采后病害及操作方便的防控技术降低水果制品中毒素残留，对水果生产业和人体健康有着重要的意义。随着人们研究的不断深入，生物防治不但可以避免对水果本身造成不良影响，还能减轻或消除水果中化学药剂的残留，成为当前水果领域中的研究热点[2-3]。拮抗微生物具有效率高、无农药残留且易降解等特点，被认为是最有希望代替或者部分代替化学杀菌剂来控制水果腐败变质的措施。微生物不仅能直接抑制扩展青霉，还能吸附或降解展青霉素，将生物防治手段与传统控制方法相结合，有利于提高对扩展青霉的防治效果和解决展青霉素的污染难题。

本文综合介绍了扩展青霉和展青霉素在水果及其制品中的污染情况、传统控制手段和生物防治研究进展，以期为生物防治技术在控制扩展青霉生长和展青霉素产生方面的发展与应用提供参考。

1 扩展青霉和展青霉素的污染现状

1.1 扩展青霉的毒力性质及其在水果中的污染

扩展青霉在水果及其制品中分布广泛，研究者不仅在苹果、葡萄、梨果、猕猴桃、番茄和橄榄等水果中分离得到了该菌株，在苹果汁、梨泥和番茄酱等水果制品中也发现了它的存在[7-13]。除了侵染宿主范围较广之外，扩展青霉菌株的生长范围也遍布全世界[14]。在发达国家，因致病菌侵染而造成的果品腐败率为20%～25%，而在发展中国家，由于相对落后的贮藏条件及保鲜技术，果品腐败率在30%～50%及以上[15]。

1.2 展青霉素的毒性作用及其在水果制品中的污染

展青霉素具有多种毒性，可引发机体急性病症、慢性病症和细胞水平病变等病症[16]。急性病症包括兴奋、抽搐、肺部肿胀、充血、胃溃疡、肠炎和上皮细胞恶化。慢性病症包括神经毒性、遗传毒性、免疫毒性、免疫抑制、致畸和致突变。展青霉素会改变细胞膜的通透性，造成K+过度流失，大分子物质合成受到抑制，导致细胞活性的丧失。细胞水平的病变包括原生质膜破裂以及DNA、RNA和蛋白质合成受阻等。胃肠道是抵抗展青霉素的首要生理屏障，毒素入侵肠道后会损伤肠道健康。肠道屏障功能的破坏会使展青霉素进入血液并激活免疫系统，导致内毒素血症、炎症和肠道的病变[17]。除了对胃肠道具有不良影响之外，展青霉素还会损伤肝和肾脏等重要器官[18]。

扩展青霉侵染果实后，它产生的次级代谢产物即展青霉素会在水果中大量积累。由于展青霉素易溶于水并在酸性条件下稳定，且2%～6%的展青霉素还会扩散到腐烂组织周围的新鲜组织中，而去除腐烂组织的水果又常被加工成果汁、果酱和果干等制品，从而造成展青霉素在上述水果制品中的残留。鉴于展青霉素的毒性，各国对食品中展青霉素含量制定了严格的限量规范。世界卫生组织、欧盟及美国食药管理局规定，展青霉素在果汁中的最大限量为50 μg/kg；同时，欧盟将苹果固态制品、苹果制成的婴儿食品中展青霉素的最大限量分别设置为25和10 μg/kg；我国将苹果、山楂制品中展青霉素的最大限量设定为50 μg/kg。研究发现，欧洲各公司生产的35份梨汁样品中，展青霉素污染水平在5～92 μg/kg，平均含量为43 μg/kg，其中，有14份超过最高限度50 μg/kg[19]。展青霉素对水果制品的污染情况较为严重，如何降低展青霉素的含量已成为世界水果领域亟待解决的重要问题之一。

2 扩展青霉和展青霉素的传统控制方法

2.1 采后水果中扩展青霉的传统控制方法

2.1.1 物理方法

物理方法主要包括人工挑拣、巴氏杀菌和控制贮藏条件等。利用拣选去除烂果并加以清洁整理能有效剔除腐烂严重的果实，但苹果经严格挑选后，仍有20%在货架期内会感染扩展青霉[20]。巴氏杀菌会破坏扩展青霉的孢子，但同时也会改变水果的理化性质和风味品质。贮藏条件中，低温能降低果实中乙烯的释放量并减弱病原菌生长繁殖的能力，气调贮藏通过人工调节O2和CO2的比例能达到防腐保鲜的目的，将低温和气调贮藏相结合能有效抑制扩展青霉的生长[21]。在低或超低O2和CO2条件下，1 ℃贮藏2～2.5个月的苹果中均未检测到扩展青霉，但冷藏后的苹果再放置在室温下，其上扩展青霉的生长会被重新激活[22]，因此，对冷藏结束的水果应尽快消费或加工。

2.1.2 化学方法

化学方法主要使用杀真菌剂如苯并咪唑类药物，但化学杀菌剂的滥用会导致水果病原菌产生耐药性，有的甚至会促进致病菌的生长，由此带来的农药残留问题也会危害人体健康。因此，一些化学杀菌剂已经失效，应使用杀菌剂替代品来进行控制。近年来，研究发现植物生物活性提取物能提高果蔬的贮藏效果。罗曼等[23]通过离体和活体实验发现26.0 μL/L的丁香精油熏蒸能明显抑制固态培养中扩展青霉孢子萌发、菌落延展和毒素积累，且能保持苹果原有的营养和风味。邬波龙[24]发现草酸在降低猕猴桃中维生素C损失的同时，能减少丙二醛的合成并提高总酚的含量及过氧化物酶的活性，进一步增强果实的抗病性，从而延缓猕猴桃青霉病的发病时间和有效控制猕猴桃上青霉的病斑直径。

2.2 水果及其制品中展青霉素的传统控制方法

2.2.1 物理方法

物理方法主要包括澄清、吸附、辐射和微波处理等。高压水澄清可以去除苹果汁中45%的展青霉素[25]，然而经澄清后，展青霉素会转移到清洁水体中，且需要建设相应的清洗设备。ACHACHLOUEI等[26]发现3 g/L的活性炭在30 min内能成功吸附苹果汁中97%的展青霉素，但吸附会导致果汁色泽改变和酚含量降低。DIAO等[27]利用紫外辐射来脱除苹果汁中的展青霉素，在254 nm、3.8 mW/cm2下照射5 min后，展青霉素含量减少了83%，但过高的辐射剂量会改变果汁的理化特性和营养品质。GAO等[28]探究了微波法处理对苹果汁中展青霉素的降解，在420 W、28 kHz和30 ℃下作用90 min，能清除果汁中69%的展青霉素，但由于生产工艺繁琐和成本昂贵，目前该技术仍停留在试验阶段。

2.2.2 化学方法

化学方法主要包括添加巯基化合物和臭氧处理等。谷胱甘肽、半胱氨酸和巯基乙酸等巯基化合物能与展青霉素反应并生成具有生物活性的化合物。臭氧能有效清除苹果汁中98%的展青霉素，但果汁品质会因此受到影响[29]。近年来，研究发现食品添加剂和天然植物提取物能有效去除展青霉素及降低其毒性。ASSAF等[30]将抗坏血酸添加到被展青霉素污染的苹果汁，在22 ℃下处理6 d，能清除果汁中60%的展青霉素。SONG等[31]发现绿茶多酚会影响血清ALT和AST水平并对肝脏起保护作用，预防脂质过氧化及缓解展青霉素的遗传毒性。

3 扩展青霉和展青霉素的生物控制进展

3.1 扩展青霉的生物控制进展

3.1.1 酵母菌

酵母能在果皮表面快速繁殖，且不产生过敏性孢子和毒素。毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)是国际上最早被报道能抑制水果病原菌的生防酵母，假丝酵母在1995年被美国环境保护署(U.S.En ironmental Protection Agency,EPA)注册为生物杀菌剂，并由Ecogen公司商业化[32]。目前，普遍认为酵母抑制扩展青霉的机制为以下两方面：(1)直接作用：竞争营养和空间并分泌抗菌物质来抑制扩展青霉生长；(2)间接作用：提高果实抗性相关酶的活性来诱导寄主水果产生抗性。

在扩展青霉到达后的短时间内，酵母能快速占据侵染部位并抢夺碳源和氮源，使扩展青霉得不到有效的营养与生存空间。SPERANDIO等[33]将2株酵母分别接种到含青霉的柑橘表面，3 d后柑橘腐败率相应降低30%和18%，但从第5天起，柑橘腐败率达到和空白对照组相当的水平，这表明酵母主要的抑菌机理是进行营养与空间的竞争。同时，酵母能分泌丝状粘性生物膜，帮助酵母紧紧附着在水果、扩展青霉的接触面，干扰病原菌获取宿主中的营养物质。桔梅奇酵母能附着在柑橘表面的青霉菌丝上并形成生物被膜，酵母产生的栗色色素会消耗青霉生长所需铁离子，并间接降低青霉胞内活性氧水平以起到抑菌效果[34]。

此外，酵母能诱导果实防御酶的产生及活性的提高，同时升高果实体内活性氧代谢相关酶的活性，起到增强水果抗病性的作用。毕赤酵母能诱导梨肉组织中17个蛋白的上调和13个蛋白的下调，且大部分变化的蛋白与果实防御和逆境响应有关[35]。红东孢酵母(Rhodosporidiumkratoch ilo ae)能提高梨果体内β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶及苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，并增强果实病程相关蛋白基因(PR1-like，endoGLU9，endoCHI-like和PR4)的表达，经酵母处理后，梨果上青霉的病斑直径得到显著降低[36]。将酵母应用于水果表面可以调节果实的抗病反应，但针对酵母拮抗的生理机制和其分泌物诱导水果产生抗性的能力还需做进一步的深入探究。

3.1.2 细菌

细菌个体微小，能在水果表面大量存活且高速定殖，便于生产加工成生防菌剂。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、根癌农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)和球形红假单胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)能将苹果腐烂直径分别减少38%、28%和24%[37]。其中，芽孢杆菌能产生耐热抗逆的芽孢，在稳定性方面明显优于其他细菌，迄今己有4株枯草芽孢杆菌获得美国环境保护署的商品化生产应用许可。

细菌能破坏扩展青霉的菌丝体并抑制孢子的萌发。荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescensstrain 1-112不仅能黏附在扩展青霉菌丝体上，还能定殖在扩展青霉孢子上，致使扩展青霉生长受阻[38]。同时有研究发现，细菌能产生抑菌代谢产物来破坏扩展青霉细胞壁的完整性，改变细胞膜的渗透性并造成膜内物质外泄以杀死病原菌。假单胞菌Pseudomonsadaceaestrain YL11分泌的抑菌物质会造成扩展青霉菌丝生长畸形、产孢能力下降，有效抑制苹果接种扩展青霉后的发病率及其病斑直径的扩展。进一步分析发现，经YL11无菌发酵液处理后，扩展青霉细胞壁结构失去完整性，胞内核酸和蛋白质大量渗漏，细胞代谢发生紊乱，进而扰乱扩展青霉的正常生长[39]。此外，细菌能诱导病原菌细胞组织结构发生变化，提高与果实自身抗性相关酶的活性以保护宿主水果。蜡状芽孢杆菌Bacilluscereusstrain AR156能诱导增强甜樱桃中几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，使得扩展青霉孢子的质膜完整性遭到破坏，造成菌丝体上蛋白质和多糖外渗，对樱桃上扩展青霉的抑制率高达79%[40]。

乳酸菌是广泛应用于发酵食品中的、被普遍认为安全的一类细菌，它的代谢产物如有机酸、脂肪酸和环二肽等能抑制腐败菌的生长，因此乳酸菌也是一类重要的生防细菌。清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)对扩展青霉的抑菌效果较好，抑制率能达到69%，当清酒乳杆菌中乳酸和乙酸的含量为6.52 μg/mL和2.62 μg/mL时，分别能抑制68%和67%的扩展青霉，推测乳酸和乙酸起主要抑菌作用[41]。关于乳酸菌发酵液抑菌特性及稳定性方面的报道还不多见，为真正实现其商业化应用，还需做大量的探究工作。

3.2 展青霉素的生物控制进展

3.2.1 吸附作用

作为新兴的毒素处理技术，生物吸附法是利用对人体无害的微生物来进行吸附的，有着特异性强、成本低廉和使用安全等优点，酵母及乳酸菌等被广泛应用于果汁生产中。将失活酵母菌粉添加到猕猴桃果汁能最高清除其中81%的展青霉素，且不会引起果汁色值、总糖、总酸及可溶性固形物含量发生变化，成品果汁质量符合国家相关标准，吸附动力学结果表明失活酵母细胞对展青霉素的清除是通过单层及多层的表面吸附来进行的[42]。

先前研究发现，微生物细胞主要借助细胞壁来完成对展青霉素的吸附。骆莹[42]对4株细胞及细胞壁组成不同的酵母分别展开展青霉素吸附试验，在吸附能力方面，失活酵母细胞与活细胞相比无显著差异；胞壁受损的酵母细胞对展青霉素的吸附能力明显降低，仅为完整细胞的50%；胞壁缺失的酵母原生质体对展青霉素几乎失去吸附能力。同时指出酵母细胞受到破坏后，单一的完整酵母细胞壁无法对展青霉素起吸附作用，证明细胞及细胞壁结构的完整性是细胞吸附的重要前提。近来研究表明，微生物细胞壁组分在细胞吸附展青霉素的过程中扮演着关键角色。ZHANG等[43]采用傅里叶变换红外光谱探究酿酒酵母(Saccharomycescere isiae)对展青霉素的吸附机理，发现参与吸附的主要官能团是O—H和N—H，它们存在于酵母细胞壁的蛋白质和多糖上，这说明在吸附展青霉素的过程中，细胞壁上的蛋白质和多糖起比较重要的作用。热灭活短乳杆菌Lactobacillusbre isstrain 20023细胞壁肽聚糖层中的C—O、O—H和N—H基团能起吸附展青霉素的效应[44]，因此，短乳杆菌吸附展青霉素的能力受细胞壁肽聚糖结构及氨基酸组成的影响。

微生物细胞形态和表面性质会显著影响其对展青霉素的吸附效果。当酿酒酵母细胞呈整体皱缩和局部凹陷时，它对展青霉素的吸附能力明显下降[45]。微生物细胞表面性质包括细胞壁化学组成、体积、表面积及其壁厚度等。酵母吸附展青霉素能力的强弱主要与β-1,3-葡聚糖和少量几丁质构成的细胞壁网状结构有关，细胞壁中β-1,3-葡聚糖和几丁质的数量越多，越有助于酵母细胞与展青霉素之间的结合。细胞壁结构受到破坏后，相应地，细胞壁体积、表面积和壁厚度也会发生改变，且酵母细胞壁体积、表面积和壁厚度的大小与展青霉素吸附率呈正相关。此外，酵母对展青霉素的吸附作用还受到吸附时间、吸附剂添加量、反应温度和展青霉素初始浓度的影响[42]。

3.2.2 降解作用

生物降解不受菌体量的限制，只要微生物有活性，就能持续发挥高效降解作用。研究发现，起生物降解作用的微生物主要包括真菌和细菌。自1997年，研究发现酵母发酵能去除90%的展青霉素后[46]，学者将真菌降解的研究重点主要放在酵母菌上。近年来，研究表明乳酸菌能明显脱除溶液中的展青霉素[47]，成为利用细菌控制展青霉素含量方面的重点研究对象。

关于微生物降解展青霉素的生理机制，研究表明该降解过程需要微生物活细胞的存在。ZHANG等[43]探究了不同状态的酿酒酵母对展青霉素清除率的差异，发现完整酵母细胞能去除溶液中全部的展青霉素，而失活酵母细胞和酵母原生质体对展青霉素的清除率仅为19%和35%。干酪乳杆菌Lactobacilluscaseistrain YZU01能去除溶液中97%的展青霉素，但YZU01热致死菌体仅能去除21%的展青霉素[48]。由此证明微生物降解展青霉素效果的好坏依赖于它自身的细胞活力。

在实际生产中，除某些发酵制品外，能降解展青霉素的微生物不便于直接用做毒素的脱除。为了加快其商业应用，需要找到直接降解展青霉素的关键物质并加以利用。先前研究表明，展青霉素会诱导微生物分泌相关酶蛋白，这些诱导酶能提高微生物自身代谢和抗环境胁迫能力，并通过酶促反应来降解展青霉素。CHEN等[47]通过基于iTRAQ的定量蛋白质组学分析发现展青霉素刺激会引起30个蛋白的丰度发生改变，其中，短链脱氢酶(SDRs)的丰度在24和48 h时分别增加了51倍和21倍，SDRs丰度的降低可能与溶液中展青霉素含量的下降有关，若在酵母发酵时添加蛋白合成抑制剂—环己酰胺，在阻挠酵母蛋白质合成的同时也会间接影响酵母对毒素的降解。同时，运用RT-qPCR技术发现SDRs对应mRNA的丰度在24 h时增加了66倍，表明它相应的编码基因同样受到展青霉素的强烈诱导，由此推测SDRs参与了毒素的降解过程。

运用生物降解技术之前，还必须明确毒素降解产物的化学种类和毒性情况。研究表明，展青霉素降解产物主要有2种，即desoxypatulinic acid(DPA)和Z-ascladiol，它们在毒性上均显著低于展青霉素。海洋红酵母Rhodosporidiumpaludigenumstrain 394084能将展青霉素降解为对大肠杆菌无毒的DPA[49]，推测大肠杆菌可能以DPA为营养物质来促进其生长，相较于展青霉素，DPA不会抑制某些细菌和酵母菌的生长，且DPA对植物体、人体肝细胞及淋巴细胞的毒性要比展青霉素低得多。DONG等[50]基于高效液相色谱法和LC-TOF/MS分析发现，海洋酵母Kodameaeohmeristrain HYJM34能将绝大部分的展青霉素降解为它的前体物质E-ascladiol，E-ascladiol会转化为它的同分异构体Z-ascladiol。对大肠杆菌、植物体和人食管上皮细胞来说，E/Z-ascladiol并没有表现出毒性[50]。

4 小结与展望

真菌毒素污染事件频发，公众对食品安全的关注度不断提升。扩展青霉侵染和其次级代谢产物展青霉素超标不仅成为我国水果及其制品出口的阻碍，还会对消费者健康产生严重威胁。因此，如何安全高效地控制水果中扩展青霉的生长和水果制品中展青霉素的残留，对于世界水果产业的快速、健康发展具有重要的现实意义。传统控制扩展青霉和展青霉素的方法，如物理方法和化学方法，不仅不能从根源上避免污染，还会引起水果的理化性质和感官品质发生改变，安全稳定性得不到保障，很难推广应用。与传统方法相比，生物方法因其成本低、操作简单及效果显著的特点受到人们的密切关注，是一种发展前景十分广阔的新型处理技术，运用微生物贮藏采后果实及处理水果制品是非常安全有效的。近年来，研究者在控制水果病害及毒素残留方面取得了一定的进展，发现了一些既能有效抑制扩展青霉又能很好清除展青霉素的生物拮抗菌。

目前，国内外关于微生物防治水果青霉病和控制展青霉素污染方面的研究，大都集中于微生物吸附或降解展青霉素的体外实验。关于直接将微生物用于抑制扩展青霉生长的研究才刚刚起步，存在抑菌时间短、水果表面黏附性差及拮抗菌安全性等问题，在水果拮抗菌与扩展青霉间的相互作用、拮抗菌控制展青霉素的生物合成及体内降解展青霉素机制这方面的研究较少，不能系统全面地解读微生物调控扩展青霉和展青霉素的作用方式，这限制了生物防治在水果采后腐败及毒素控制方面的应用。因此,未来研究工作需要重点集中在生物防治机理的研究，加强预防扩展青霉对水果的侵染，高度重视生物拮抗菌的发掘与利用，寻找对展青霉素具有吸附作用的物质并进行纯化与化学合成，利用分子生物学手段得到降解展青霉素的酶等物质的表达基因。进一步阐明微生物抑制扩展青霉生长和降低展青霉素合成的机制，对于控制采后水果青霉病及其制品中真毒毒素的污染具有极大的经济和社会价值。