β2-糖蛋白Ⅰ对VEGF诱导的巨噬细胞迁移的影响

宋振强 王靖宇 周赛君 于珮

天津医科大学朱宪彝纪念医院，国家卫生健康委员会激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室 300070

2型糖尿病已成为全球流行性疾病。据2013年我国慢性病及其危险因素监测显示，18岁及以上人群糖尿病患病率已高达10.4%[1]。而随着糖尿病患病率的急剧增加，糖尿病肾脏病(DKD)已成为慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病(ESRD)的主要原因[2-3]。其发病机制与遗传因素、糖代谢紊乱、血流动力学改变、持续低水平炎性反应及氧化应激等相关。近年来，巨噬细胞在DKD发病中的作用及机制逐渐引起人们的注意。在糖尿病发展过程中，代谢、内分泌和血流动力学紊乱可以促进慢性炎性反应状态的发生、发展，在肾组织中则表现为大量巨噬细胞聚集，且与肾脏损伤和肾功能减退的进展相关，但具体机制尚不明确。血管内皮生长因子(VEGF)是主要的巨噬细胞趋化因子之一，它主要在肾小球足细胞和肾小管上皮细胞产生，是血管生成的主要调节因子；也可以诱导单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达，促进单核细胞趋化和黏附分子的表达增加。β2糖蛋白Ⅰ(β2-GP)也称载脂蛋白H(ApoH)，是一种相对分子质量为50 000的单链血浆糖蛋白，在很多自身免疫性疾病患者的血清中都有发现，肝胆管和近端肾小管上皮细胞是合成β2-GP的主要场所。在肾小管功能损害早期，尿中β2-GP排泄增加。研究发现，用免疫组化的方法可以检测到β2-GP与凋亡的巨噬细胞共定位于人冠状动脉。VEGF通过激活单核细胞表达血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，进而促进其下游p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化而诱导单核细胞迁移，β2-GP可以抑制上述过程。

因此，本研究欲通过体外实验观察VEGF对巨噬细胞的趋化作用，以及β2-GP对VEGF诱导巨噬细胞迁移的影响，并初步探讨其影响是否与p38信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264.7(天津医科大学免疫教研室馈赠)，10%胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)，β2-GP(实验室制备)，重组小鼠VEGF(Peprotech 公司)，SB203580(碧云天生物技术研究所)，MCP-1、IL-8及巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β) ELISA试剂盒(美国R&B公司)，小鼠β-actin单克隆抗体、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体及兔抗小鼠磷酸化p38MAPK多克隆抗体(Cell Signaling Technology)，兔抗小鼠VEGFR1多克隆抗体(Thermo Scientific公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(北京康为世纪生物有限公司)。

1.2 细胞培养及分组 以小鼠单核/巨噬细胞系RAW 264.7为研究对象，细胞置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养，每日更换新鲜培养液，待细胞生长至约90%融合时即传代，选择处于对数生长期、细胞形态饱满、状态良好的细胞进行实验，按表1进行分组。

1.3 Transwell细胞迁移实验 将Transwell培养板下室加入600 μl培养液，上室加入100 μl培养液后

表1 细胞分组情况

放于37℃、5% CO2细胞培养箱内预孵育2 h。接种细胞，弃去上室培养液，加入100 μl细胞密度为105/ml的细胞悬液，下室换新鲜的细胞培养液。放于37℃、5% CO2细胞培养箱内孵育。2 h后细胞贴壁，根据表2加入干预因素(上室体系100 μl，下室体系600 μl)，同一组别设置3个复孔，37℃、5% CO2细胞培养箱内孵育6 h。取出Transwell培养板，弃去上下室培养液，下室加入600 μl 10%中性福尔马林溶液，上室加入100 μl 10%中性福尔马林溶液，固定10～15 min。弃去上下室固定液，下室加入600 μl台盼蓝染液，上室加入100 μl台盼蓝染液，染色5～10 min。染色后用PBS缓冲液稍洗，用棉签轻轻擦去上室上表面细胞，倒置显微镜下观察，每孔计数6个高倍视野细胞数，计算平均值(即迁移至小室下表面的细胞数)。

表2 Transwell细胞迁移实验

1.4 MCP-1、白细胞介素-8(IL)-8及MIP-1β的表达 将密度为1×105/ml的细胞悬液接种于六孔细胞培养板中(2 ml/孔)，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。经无血清饥饿培养过夜后，按表1加入干预因素。细胞置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养6 h后从培养箱内取出，小心吸取上清于无菌管中，离心20 min(2 000～3 000 r/min)，仔细收集上清，ELISA法检测上清液中MCP-1、IL-8及MIP-1β的浓度，严格按试剂盒说明书操作。

1.5 VEGF信号通路变化 将密度为1×105/ml的细胞悬液接种于六孔细胞培养板中(2 ml/孔)，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。经无血清饥饿培养过夜后，按表1加入干预因素。培养6 h之后，弃去培养液，收集细胞并提取细胞总蛋白。Western印迹检测VEGFR1、p38MAPK及磷酸化p38 MAPK表达。BCA法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，曝光显影，凝胶成像仪记录目的蛋白灰度值，计算目的蛋白表达水平并进行统计分析。

2 结果

2.1 Transwell细胞迁移实验(图1，封3)

2.1.1 VEGF对巨噬细胞具有趋化作用 与A组相比，B组巨噬细胞迁移的数量增加(t=22.089，P<0.05)。

2.1.2 p38抑制剂可抑制VEGF对巨噬细胞的趋化作用 与B组相比，D组巨噬细胞迁移明显降低(t=63.625，P<0.05)。

2.1.3 β2-GP可以抑制VEGF诱导的巨噬细胞迁移作用 与B组相比，C组巨噬细胞的迁移明显减弱(t=22.687，P<0.05)。A组和E组巨噬细胞迁移的数目有差异(t=4.602，P<0.05)。

2.2 VEGF诱导MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌 与A组相比，B组巨噬细胞趋化因子MCP-1、IL-8及MIP-1β的分泌增加(t=3.339、11.140、 2.254,P均<0.05)，与B组相比，C组和D组抑制VEGF诱导的3种趋化因子的分泌减少(t=3.148、2.402、2.798、6.754、4.459、5.528，P均<0.05)，见图2。

2.3 β2-GP对VEGFR1表达及p38MAPK信号通路的影响

2.3.1 β2-GP可抑制VEGF诱导的VEGFR1表达 Western印迹结果显示，与A组相比，B组巨噬细胞VEGFR1的表达增加(t=5.161，P<0.05)，与B组相比，C组巨噬细胞VEGFR1表达降低(t=4.965，P<0.05，图3)。

2.3.2 β2-GP降低VEGF诱导的巨噬细胞p38MAPK通路的激活程度 与A组相比，B组巨噬细胞p38MAPK通路的磷酸化程度增加(t=12.384，P<0.05)，与B组相比，C组磷酸化程度降低(t=6.581，P<0.05)，但高于A组(t=6.323，P<0.05)。

3 讨论

近年来，随着人们生活方式与饮食结构的变化，糖尿病的患病率不断上升，而由糖尿病所致的肾病也十分普遍，现已成为CKD和ESRD的重要诱发原因。然而，即使严格的控制糖脂代谢紊乱仍无法控制DKD的发生、发展，因此，研究DKD的发病机制以及寻找有效的预防和治疗策略已迫在眉睫。

既往研究结果提示，DKD相关因素包括遗传因素、高血糖、血液动力学改变、血脂紊乱、氧化应激等[4]。而近年来，持续低水平炎性反应逐渐被人们认识，尤其是巨噬细胞介导的炎性反应可能是DKD发生、发展的关键因素之一。巨噬细胞是肾小球高滤过所致肾损伤中的一个关键因子[5]。巨噬细胞浸润程度与白蛋白尿水平、血肌酐水平、肾小球硬化程度和肾间质纤维化程度相关[6]。用来氟米特等免疫抑制治疗可明显减轻DKD巨噬细胞的浸润程度，从而延缓了DKD的进展[7]。巨噬细胞在受到炎性因子等刺激时会诱导合成诱导型一氧化氮合酶，催化合成大量的一氧化氮，导致肾小球毛细血管高灌注、高滤过的状态，参与肾脏损伤。糖尿病状态下，巨噬细胞可以通过产生IL-1和血小板源性生长因(PDGF)，促进成纤维细胞的增殖，进而促进肾脏纤维化的发生[8]。

VEGF又称为血管通透因子，是重要的促血管生成活性的生长因子，对内皮细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用，增加了血管的通透性，在调节正常和病理性血管生成过程中发挥了重要作用[9]。此外，VEGF也是主要的巨噬细胞趋化因子之一，它主要在肾小球足细胞和肾小管上皮细胞产生，是血管生成的主要调节因子；也可以诱导MCP-1的表达，促进单核细胞趋化和黏附分子的表达。Zorena等[10]研究表明，血清VEGF水平升高是1型糖尿病微血管并发症的独立影响因素，并且VEGF水平与糖化血红蛋白呈正相关。Pascal等[11]通过建立DKD的动物模型，发现肾小球VEGF-A水平升高，并且多项研究表明，在糖尿病动物模型中抑制VEGF-A可以预防白蛋白尿和肾小球肥大。VEGF以自分泌作用于肾小球足细胞，通过VEGF/VEGFR1途径介导足突的消失和肾小球基底膜增厚；以旁分泌作用于内皮细胞，通过VEGF/VEGFR2途径促进血管内皮细胞的增殖和迁移，进而诱导新生血管的形成，亦可增加内皮通透性；同时作为趋化因子招募巨噬细胞，通过VEGF/VEGFR1途径促进巨噬细胞肾小球及肾间质的浸润[12]。

VEGFR1是在单核细胞上表达的唯一的VEGFR，VEGF诱导的单核细胞迁移是由VEGFR1(Flt-1)介导的。使用VEGF-A抑制剂sFlt-1转染先前存在肾脏损害的1型糖尿病小鼠模型，发现sFlt-1可减少内皮细胞激活，降低肾小球巨噬细胞浸润[11]。单核-巨噬细胞迁移活性是由p38MAPK途径介导的，VEGF可以激活单核细胞表达VEGFR1，进而促进其下游p38MAPK的磷酸化，该过程在VEGFR1介导的单核细胞趋化反应中起关键作用[13]。

在本实验中，通过Transwell迁移实验可以看到VEGF可以诱导巨噬细胞迁移(P<0.05)，发挥趋化因子的作用，并且VEGF可以诱导巨噬细胞分泌其他趋化因子，本实验中MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌均增加(P均<0.05)。而用p38MAPK抑制剂SB203580可以明显抑制巨噬细胞的迁移(P<0.05)以及3种趋化因子的分泌(P均<0.05)。Western印迹检测显示，VEGF可以明显促进巨噬细胞表达VEGFR1，以及p38MAPK通路的磷酸化(P均<0.05)，说明VEGF通过作用于巨噬细胞表面VEGFR1，进而激活其下游p38MAPK通路的磷酸化而介导巨噬细胞的迁移，与Tchaikovski等[13]的结果一致。

β2-GP也称ApoH。肝胆管和近端肾小管上皮细胞是合成β2-GP的主要场所，在肠道、胎盘等部位也发现了β2-GP mRNA的表达。已证明β2GP对糖尿病动脉粥样硬化和视网膜新生血管形成具有积极作用[14]。此外，Chiu等[15]通过体内和体外研究发现，β2-GP在人主动脉内皮细胞(HAECs)中了抑制VEGF诱导的血管生成。这些结果表明β2-GP在新生血管和预防血管生成相关疾病中具有重要作用。Wang等[16]研究发现，在2型糖尿病患者体内，β2-GP表达水平显著高于正常人，有并发症的2型糖尿病患者β2-GP表达水平高于无并发症患者。而降低β2-GP可改善DKD的结构损害和肾功能，并对DKD起到肾脏保护和抗纤维化作用，这与抑制转化生长因子-β1-p38MAPK途径的激活密切相关[14]。

在Transwell细胞迁移实验和ELISA实验中观察到，β2-GP对巨噬细胞迁移活性以及分泌功能无显著影响，与A组差异无统计学意义(P>0.05)。用Western印迹检测p38MAPK的磷酸化程度，发现β2-GP 对p38MAPK通路有轻度的激活作用(P<0.05)。在本实验中，Transwell细胞迁移实验显示，β2-GP可以抑制VEGF诱导的巨噬细胞迁移(P<0.05)。ELISA发现VEGF可以诱导巨噬细胞分泌趋化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β，而β2-GP可以抑制该作用(P均<0.05)。Western印迹检测p38MAPK通路的激活以及VEGFR的变化，发现VEGF可以明显增加巨噬细胞VEGFR1的表达以及p38通路的磷酸化，并且加入p38通路抑制剂后，并不影响巨噬细胞VEGFR1的表达(P均>0.05)，但Transwell实验在加入p38通路抑制剂之后细胞迁移明显降低(P<0.05)，VEGF诱导的巨噬细胞迁移是通过VEGF激活巨噬细胞表面的VEGFR1，进而磷酸化其下游通路p38MAPK来实现的。加入β2-GP后发现，VEGFR1的表达量明显降低，且p38通路磷酸化水平亦降低，但强于对照组，推测β2-GP抑制VEGF诱导的巨噬细胞迁移的作用是通过抑制VEGFR1的表达，继而部分抑制p38MAPK通路的激活来实现的。

VEGF可激活巨噬细胞表面的VEGFR1，促进其下游通路p38MAPK磷酸化，从而促进巨噬细胞趋化因子MCP-1、IL-8以及MIP-1β的分泌、诱导巨噬细胞迁移；β2-GP通过抑制VEGFR1表达，并部分抑制上述过程。本研究正在进行进一步探讨，该方向有望为DKD新的治疗靶点提供参考。