响应面分析法优化鱼露挥发性风味物质萃取工艺

陈丽丽,白春清,袁美兰,江 勇,赵 利,*

(1.江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌 330013; 2.国家淡水鱼加工技术研发分中心,江西南昌 330013)

鱼露是一种高营养的水产调味品,是一种清澈的棕色液体,味道鲜美。鱼露主要以低价值的鱼、虾及其加工的副产物为原料,与一定比例的食盐混合,利用原料自身的内源性酶和多种微生物之间的共同作用,通过分解和发酵原料中的脂肪、蛋白质和其它成分制成的液体调味品[1]。鱼露具有鱼虾等水产品原料特有的风味,是东亚及东南亚各国必需的日常调味料,也是这些地区居民膳食中主要蛋白质的来源之一[2]。

人类虽然很早就开始食用鱼露,但对鱼露的风味物质却并不是完全了解,国外对鱼露的研究主要集中在风味和微生物方面[3-6]。近年来随着对鱼露的进一步研究,关于鱼露呈味方面的报道层出不穷,对于鱼露风味已经有了一部分的了解。鱼露风味组成相当复杂,Katsuya等[7]通过炙烤香、鱼腥味、氨味、酸败味、奶酪香、肉香来描述鱼露的特征性风味;Pham等[8]通过鱼腥味、奶酪味、黄油爆米花味和熟米饭味来描述鱼露的特征性风味;Giri等[9]认为鱼露的主要特征气味是坚果味、奶酪味、氨味、鱼腥味,其中氨、胺类等构成氨味。Shimoda等[10]对鱼露进行碱化处理,提高了鱼露中含氮和含硫化合物的释放,采用GC-MS分析法对鱼露的挥发性物质进行检测,初步鉴定了124种化合物,碱化后对三甲胺、二甲基二硫等不易被现有方法检测到的高挥发性含氮含硫化合物检测得到了加强。Yimdee等[6]采用气相色谱-质谱-嗅闻技术(GC-MS-O)对14种鱼露中的挥发性化合物进行检测,共检定了79种化合物。挥发性成分是调味品中主要的商业元素,虽然占比较小,但却是区别两种食品的一个重要质量特征,是衡量食品品质的重要因素[11]。作为调味品,风味的研究对提高鱼露的质量和品质具有重要的指导意义[12]。鱼露是发酵产品,其发酵过程是以其原料中的蛋白质、脂质和糖类等营养物质为基础,在微生物和酶的作用下发生以营养物质分解为主体的一系列复杂代谢活动,逐渐产生醇、酯、醛、酮等化合物[13-14],最终才有了鱼露独特的风味。

目前有许多关于鱼露的营养成分的研究,但对于鱼露的风味成分却并不是完全了解。全二维气相色谱质谱具有较高的分离度和分辨度,其峰容量相当于两个色谱柱各自峰容量的乘积,适用于复杂样品的分析,根据不同的样品类型以及不同的分离效率和分类特征(官能团、极性、沸点等),选择不同的二维柱系统,因此极大地提高了光谱峰值分析的准确度。本文建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS联用能较好地分析测定鱼露挥发性风味物质的相对百分比,更好的对样品中的成分进行分离,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,测定结果真实且较为全面地反映银鱼鱼露中挥发性物质的组成,可以为鱼露产品的品质检测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银鱼鱼露 青岛正道食品有限公司;混合正构烷烃标准溶液 美国Restek公司;2,4,6-三甲基吡啶标准品 美国Afla Aesar公司;氯化钠 上海麦克林生化客家有限公司。

AOC-5000顶空-固相微萃取三合一自动进样器 瑞士CTC公司;65 μm P DMS/DVB固相微萃取头萃取头 美国Supelco公司;GCMS-TQ8050三重四极杆型气质联用仪 日本岛津公司;20 mm聚四氟乙烯磁性盖头 德国CNW公司;20 mL顶空瓶 美国Altech公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼露风味物质的萃取 向20 mL的顶空瓶中加入5 mL鱼露样品和5 g NaCl,振摇1 min,使其达到过饱和,加入10 μL浓度为0.05 mg/L的标准品2,4,6-三甲基吡啶,然后用聚四氟乙烯磁性盖头迅速密封,置于自动进样器中。萃取头(250 ℃活化30 min)顶空吸附20 min后,迅速将萃取头插入气相色谱进样口解吸5 min,然后进行GC×GC-MS分析,每组样品分别测5个平行样品。

1.2.2 单因素实验 将HS-SPME-GC×GC-MS检测鱼露时设定的参数作为单因素,包括萃取温度、萃取时间和振荡频率。取市售银鱼鱼露进行单因素实验。每个条件做三次平行试验。

1.2.2.1 萃取时间的优化 取5 mL鱼露样品按照上述样品处理方法预处理后放入20 mL顶空瓶中进行风味成分的萃取,固定萃取温度为50 ℃、振荡频率500 r/min保持不变,萃取时间设定按照30、40、50、60、70和80 min,进行样品风味物质测定来优化萃取时间。

1.2.2.2 萃取温度的优化 取5 mL鱼露样品按照上述样品处理方法预处理后放入20 mL顶空瓶中进行风味成分的萃取,固定萃取时间60 min、振荡频率500 r/min保持不变,萃取温度设定按照40、45、50、55、60、65和70 ℃,进行样品风味物质测定来优化萃取温度。

1.2.2.3 振荡频率的优化 取5 mL鱼露样品按照上述样品处理方法预处理后放入20 mL顶空瓶中进行风味成分的萃取,固定萃取时间为60 min、萃取温度50 ℃保持不变,振荡频率设定按照300、400、500、600和700 r/min,进行样品风味物质测定来优化振荡频率。

1.2.3 Box-Behnken响应面法优化 根据单因素实验,对萃取温度、萃取时间和振荡频率三个因素的试验结果进行分析,根据挥发性物质的总个数和总体积来确定较优的萃取条件,采用Design Expert 8.0.6软件设计三因素三水平响应面试验方案,响应面分析因素和水平见表1,得到鱼露风味物质固相微萃取的最佳工艺,在最佳工艺的条件下进行鱼露风味物质的测定。

表1 SPME萃取实验因素水平编码Table 1 SPME extraction experimental factors level coding

1.2.4 检测分析 参考文献[15]的方法操作。

1.2.4.1 色谱条件 色谱柱一:聚乙二醇(PEG)毛细色谱柱HP-INNOWax(30 m×0.25 mm,0.25 μm);色谱柱二:ID-BPX1毛细色谱柱(10 m×0.1 mm,0.1 μm)。载气为He(99.999%);柱前压为285.7 kPa;柱箱温度为50 ℃;进样口温度为250 ℃;不分流进样;流速为1 mL/min;进样时间1 min;程序升温:起始温度为50 ℃,保持2 min,然后以2 ℃/min的速度升到250 ℃,保持10 min。

1.2.4.2 质谱条件 离子化方式为电子轰击(electron impactionization,EI),离子源温度为200 ℃,接口温度为250 ℃,电子能量为70 eV;不分流进样;溶剂延迟1.5 min后采集信号;检测模式为全扫描,扫描质量范围(m/z)45～330。

1.3 数据处理

试验结果采用平均值±标准差(Mean±SD)表示,每个试验平行4次。采用SPSS对试验数据进行差异性分析(ANOVA)检查各个结果的显著性差异,同时采用Excel 2010进行数据作图处理。响应面试验采用Design-Expert 8.0.6进行结果分析处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 萃取时间对萃取效果的影响 由图1可知,出峰个数和峰体积随着萃取时间的延长呈先升高后下降的趋势,在30～40 min内,随着时间的增加,峰体积和出峰个数增加,40～50 min这段时间,峰体积和出峰个数呈下降趋势,在60 min时,峰体积达到最高值7.55×1010,出峰个数在70 min时达到最高1346个。随着萃取时间的延长,顶空瓶中挥发性物质的浓度升高,萃取头不断吸附顶空瓶中的挥发性成分,所以检测到的出峰个数和峰体积不断升高。随着萃取时间的进一步延长,检测到的出峰个数和峰体积有所下降,这表明萃取时间过长并不一定有效。萃取一段时间后,萃取头达到饱和状态,如果时间延长,可能导致挥发性气体溢出,检测到的挥发性物质成分将减少[16]。综合考虑,最终选取60 min作为最佳萃取时间。

图1 萃取时间对萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction

2.1.2 萃取温度对萃取效果的影响 由图2可知,在萃取过程中随着萃取温度的升高,出峰个数和峰体积呈现一种先增加后下降的趋势。在40～45 ℃时,萃取的挥发性化合物峰体积和出峰个数增加,50～60 ℃温度范围内,随着温度的升高,峰体积和出峰个数也随着增加,当温度达到60 ℃时,出峰个数1663个和峰体积9.94×1010达到了最高值,这是由于顶空瓶中挥发性物质的浓度升高,被萃取头吸附的挥发性成分含量更高,所以检测到的出峰个数和峰体积也在升高。随着萃取温度的继续升高,萃取的挥发性化合物的峰体积和出峰个数呈下降趋势。当温度继续升高到70～80 ℃时,样品中的一些挥发性成分遭到破坏,检测得到的出峰个数和体积下降。萃取温度对挥发性物质的吸附有一定的影响,温度过低,沸点低的化合物不能挥发出来,但温度过高,一些化合物可能会分解和变性,同时萃取头分析挥发性化合物组分的能力将降低[17]。综合来看,选取60 ℃作为最适宜的萃取温度。

图2 萃取温度对萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction

2.1.3 振荡频率对萃取效果的影响 由图3可知,振荡频率对出峰个数和峰体积也有一定的影响。随着振荡频率的增加,出峰个数和峰体积呈现先上升后下降的趋势,在300～500 r/min振荡频率内,萃取的挥发性化合物随着振荡频率的增加峰体积和出峰个数增加,在500 r/min振荡频率,峰体积和出峰个数达到了最大1663个和9.94×1010,随着振荡频率的继续增加,出峰个数和峰体积明显减少。SPME采用的是纤维振荡的方式,可以精确控制振荡频率,提高分析的重复性。纤维头的振荡促进样品均匀化,从而液体样品连续产生新的液位,并加速了分析物从样品到顶部空间,然后从顶部空间到纤维头的传质过程[18]。综上所述,500 r/min振荡频率萃取效果最好,在此振荡频率下萃取的挥发性风味物质最多。

图3 振荡频率对萃取效果的影响Fig.3 Effect of oscillation frequency on extraction

2.2 Box-Behnken响应面法优化萃取鱼露风味物质的工艺

在单因素实验的基础上,对萃取时间、萃取温度和振荡频率进行结果分析,分别选取最佳的萃取条件,响应面分析法试验结果见表2和表3。

2.2.1 萃取鱼露风味响应面实验设计及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6对表2出峰个数结果进行多元拟合回归分析,表3为出峰个数的方差分析结果。以出峰个数为响应值对应自变量萃取温度、萃取时间和振荡频率进行横量型拟合,得到二次响应面回归模型方程为:出峰个数Y1=1541.2-8.625A+21.625B+22C-28.75AB+49.5AC+18BC-42.975A2-13.475B2-59.725C2,该模型失拟项P值大于0.05,回归项P值小于0.01,R2=0.9217,说明该模型与试验拟合良好,可用于理论推测对萃取效果的判定。

采用Design-Expert 8.0.6对表2、表4峰体积进行多元拟合回归分析,得到峰体积的二次响应面回归模型方差分析,峰体积(×1010)Y2=7.366-0.06625A+0.24375B+0.42C-0.33AB+0.6375AC-0.0575BC-0.268A2-0.173B2-0.5505C2,失拟项P值大于0.05,回归项P值小于0.01,R2=0.9185,说明该模型与试验拟合良好。

表3 出峰个数的响应面二次模型方差分析Table 3 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the number of peaks

通过对出峰个数和峰体积进行响应面二次模型方差分析,振荡频率和萃取时间对萃取效果的影响显著(P<0.05),萃取温度对萃取效果的影响不显著(P>0.05),在交互项中萃取温度/振荡频率对萃取效果的影响极显著(P<0.01),萃取时间/振荡频率对萃取效果的影响不显著(P>0.05)。由此可知,样品的出峰个数和峰体积与萃取温度、萃取时间和振荡频率之间有明显的线性关系,各个因素对鱼露挥发性化合物萃取效果影响主次因素为振荡频率>萃取时间>萃取温度。

表2 Box-Behnken响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and results ofBox-Behnken response surface

2.2.2 萃取鱼露风味响应面交互作用分析 对响应面结果进行方差和显著性检验后,依据二次多项方差拟合结果,确定其中一个因子,并绘制Y和另外两个因子的三维响应曲面图和等高线图,最佳参数和每个参数之间的相互作用可以从响应面分析图中直观地看到[19]。当特征值为正值时,响应分析图为具有最小值的山谷形曲面。当特征值为负时,它是一个具有最大值的山丘曲面。当特征值具有正值和负值时,它们是鞍形曲面,并且无极值存在[20]。根据响应曲面和等高线图,分析萃取温度、萃取时间以及振荡频率对萃取效果的影响,结果如图4～图9所示。

表4 峰体积的响应面二次模型方差分析Table 4 Analysis of the variance of the response surface quadratic model of the volume of peaks

图4 萃取时间和萃取温度对出峰个数影响的响应曲面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots of extraction time and extraction temperature on the number of peaks

图5 振荡频率和萃取温度对出峰个数影响的响应曲面和等高线图Fig.5 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction temperature on the number of peaks

图6 振荡频率和萃取时间对出峰个数影响的响应曲面和等高线图Fig.6 Response surface and contour map of the influence of oscillation frequency and extraction time on the number of peaks

图7 萃取温度和萃取时间对峰体积影响的响应曲面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of extraction temperature and extraction time on peak volume

当固定振荡频率不变时,随着萃取时间和萃取温度的增加,出峰个数逐渐增加,萃取时间增加的更显著一些,且等高线呈现椭圆形,表明萃取时间和萃取温度两个因素的交互作用比较明显;当固定萃取时间不变,随着振荡频率和萃取温度的增加,出峰个数呈现先增加后下降的趋势,且等高线呈现椭圆形,椭圆效果最明显,表明振荡频率和萃取温度两个因素的交互作用比较明显;当固定萃取温度不变时,随着振荡频率和萃取时间的增加,峰体积呈现先增加后下降的趋势,且等高线呈现椭圆形,表明振荡频率和萃取时间两个因素的交互作用比较明显。

图8 萃取温度和振荡频率对峰体积影响的响应曲面和等高线图Fig.8 Response surface and contour plot of the influence of extraction temperature and oscillation frequency on peak volume

图9 萃取时间和振荡频率对峰体积影响的响应曲面和等高线图Fig.9 Response surface and contour plots of extraction time and oscillation frequency versus peak volume

当固定振荡频率不变时,随着萃取时间和萃取温度的增加,峰体积逐渐增加,萃取时间增加的更明显一些,且等高线呈现椭圆形,表明萃取时间和萃取温度两个因素的交互作用比较明显;当固定萃取时间不变,随着振荡频率和萃取温度的增加,峰体积下降的趋势,萃取温度下降更明显,且等高线呈现椭圆形,表明振荡频率和萃取温度两个因素的交互作用比较明显;当固定萃取温度不变时,随着振荡频率和萃取时间的增加,峰体积呈现先增加后下降的趋势,且等高线呈现椭圆形,表明振荡频率和萃取时间两个因素的交互作用比较明显。

通过Design-Expert 8.0.6和综合考虑分析,鱼露风味物质成分萃取的最佳条件为:萃取温度58 ℃,萃取时间70 min,振荡频率510 r/min,该模型在此条件下，预测的出峰个数最多,为1558.55个,峰体积为7.56×1010。

2.3 鱼露挥发性风味物质检测结果

2.3.1 HS-SPME-GC×GC-MS对银鱼鱼露挥发性风味成分的分离效果 鱼露的风味组成成分十分复杂,传统的一维色谱由于分离分析能力有限,不能将其完全分离开来。采用全二维正交分离系统对鱼露挥发性风味成分进行分离,得到分离3D图结果如10所示。与一维色谱相比,具有分离度好、峰容量大、杂质干扰较小等特点[21]。全二维气相色谱具有较高的分离度和分辨度,其峰容量相当于两个色谱柱各自峰容量的乘积,适用于复杂样品的分析,根据不同的样品类型以及不同的分离和分类特征(官能团、极性、沸点等),选择不同的二维柱系统,因此极大地提高了光谱峰值分析的准确度[22]。在一维色谱上得不到很好地分离、分析的物质,在二维色谱上得到了很好地定性定量分析,二维色谱可以更好地对化合物进行定性定量分析。

图10 全二维气相对银鱼鱼露挥发性风味成分分离3D图Fig.10 3D map of volatile flavor components of fulltwo-dimensional gas relative to silver fish fish sauce

表5 银鱼鱼露中各类挥发性风味物质的数量和含量Table 5 Quantity and contents of various volatileflavor substances in silver fish sauce

2.3.2 银鱼鱼露挥发性风味物质种类分析 表5为银鱼鱼露中各类挥发性风味物质的数量和含量。根据上述响应面分析得到的最佳萃取条件,进行鱼露挥发性风味物质成分的萃取,全二维气相色谱进行检测,共检测出152种挥发性化合物物质,其中酮类11种,占1.76%;醇类26种,占26.02%;醛类6种,占5.16%;酯类20种,占10.51%;酚类6种,占1.27%;酸类19种,占11.81%;杂环11种,占2.40%;苯环18种,占2.72%;烃类14种,占25.91%;其他未分类的21种,占12.44%。其中种类最多的是醇类和酯类化合物,但含量最多的是醇类和烃类化合物。醇类挥发性物质是脂肪酸二级氢过氧化物的分解、脂质氧化酶对脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解生成,或由羰基化合物还原生成醇[23],大多呈香甜的果香,但阈值分布范围较大。酯类挥发性物质是鱼露在发酵过程中脂质代谢产物而生成的醇和羧酸的酯化作用而形成[24],多呈果香和花香味,且阈值较低,能赋予鱼露甜香、水果香、花香[25-26]。酮类挥发性物质与多不饱和脂肪酸的热氧化或降解、氨基酸降解等有关[23],具有花香和果香味,且阈值高,对食品的整体甜花香和果香风味有增强作用[27]。醇类化合物、酯类化合物、酮类化合物可能构成了鱼露风味中“肉味”,或者对其他风味有协同作用。醛类挥发性物质是多不饱和脂肪酸在微生物和酶的作用下氧化降解产生醛类物质是鱼露挥发性风味化合物的主要组成成分,酸类挥发性物质是由脂肪的水解以及脂肪氧化过程中产生,大多带有腐败、汗味或令人作呕的不愉快气味,阈值较高,对鱼露整体风味有不良影响[28]。杂环类挥发性物质形成原因较为复杂,但此类挥发性物质阈值较低,是食品的特征风味的重要组成,烃类挥发性物质是脂肪酸氧化自由基的均裂所致[29],大多带清香和香甜味,阈值和含量均较低,对鱼露的风味贡献不大[30],苯环类挥发性物质形成原因较为复杂,但此类挥发性物质阈值较低,是食品的特征风味的重要组成。

3 结论

本试验采用HS-SPME萃取鱼露的挥发性风味物质,通过单因素实验和响应面优化分析,确定鱼露挥发性风味物质的最佳萃取条件:萃取温度58 ℃,萃取时间70 min,振荡频率510 r/min,在此条件下萃取效果最好,预测得到的出峰个数最多,为1558.55个,峰体积为7.56×1010。对银鱼鱼露中的挥发性风味化合物的测定,共检测到152种化合物,可分为酮类、醇类、醛类、酯类、酚类、酸类、杂环、苯环、烃类等,其中化合物种类最多的是醇类和酯类,分别占检测到26种和20种,但测得化合物含量最多的是醇类和烃类,分别为26.02%和25.91%。

建立使用的HS-SPME-GC×GC-MS联用能较好地分析测定鱼露挥发性风味物质的相对百分比,更好地对样品中的成分进行分离,分辨率高。此方法方便、快捷且效率高,测定结果真实且较为全面地反映银鱼鱼露中挥发性物质的组成,可以为鱼露产品的品质检测提供理论参考。鱼露挥发性风味的构成非常庞大与复杂,其中仍然可能存在具备特征风味的单体物质未被发现,且各种挥发性物质之间是否存在协同作用也还未十分明确。