基于DNA甲基化/羟甲基化水平中药调控冠心病血瘀证相关基因分子生物学研究进展

张书萌，陈伶利，张湘卓，曾雪芹，张梦雪，李仙福，江雨洁，李杰

基于DNA甲基化/羟甲基化水平中药调控冠心病血瘀证相关基因分子生物学研究进展

张书萌，陈伶利，张湘卓，曾雪芹，张梦雪，李仙福，江雨洁，李杰

湖南中医药大学，湖南 长沙 410208

冠心病是多基因遗传和环境等因素相互作用的复杂性疾病，血瘀证是其常见证型之一。目前，表观遗传学是心血管领域研究的热点，通过表观遗传学机制可解释基因和环境的交互作用，冠心病的发生发展与DNA异常甲基化关系密切，而表观遗传学的修饰可逆。本文以DNA甲基化作为冠心病血瘀证新的诊疗工具，论述通过中药干预手段调控冠心病血瘀证相关基因羟甲基化修饰的研究进展，亦为中医证候本质研究提供新思路。

冠心病；血瘀证；中药干预；DNA甲基化；DNA羟甲基化；综述

冠心病（coronary heart disease，CHD）是指冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血缺氧而引起的心脏病。据心血管病流行病学调查显示，心血管病死亡率占全球总死亡率的30%，又以缺血性心脏病死亡率上升最为显著[1-2]。作为多基因遗传和环境等因素相互作用的复杂性疾病，家族和遗传因素在CHD发展过程中起到关键作用[3-5]。表观遗传学机制能很好地体现环境和基因的交互作用[6]，特别是心血管领域研究的热点DNA甲基化，其参与了多种疾病的病理生理改变[7]。研究表明，动脉粥样硬化的发生与DNA的异常甲基化关系密切[8]。研究发现，多数表观遗传学修饰具有可逆性，这种可逆性修饰为疾病的防范和治疗提供了乐观的前景。本文基于DNA甲基化/羟甲基化水平探讨中药干预对CHD血瘀证相关基因修饰调控的研究进展。

1 冠心病DNA甲基化/羟甲基化

近年来，心血管疾病被认为是受表观遗传学规律控制的人类重要疾病，现阶段DNA甲基化在心血管领域的研究仍处于探索阶段。有研究表明，基因组DNA甲基化水平异常或像MTHFR基因C677T多态性等因素造成的高同型半胱氨酸血症，均能在早期观察到冠状动脉及其他动脉的粥样硬化病变[9-12]。

动脉粥样硬化的发生亦表明与特异性基因或相关候选基因的异常甲基化改变有关联，如叉状头转录因子（FOXP3）基因[13]、XV型胶原α1（COL15A1）基因[14]、成纤维细胞生长因子2（FGF2）基因[15]等。迟映雪[16]研究发现，急性冠脉综合征患者基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因启动子甲基化水平与其冠状动脉病变程度存在相关性，提示血清MMP-9可作为急性冠脉综合征的有效生物标记物；亦有研究发现，MMP-9活性升高或高表达会加速动脉粥样硬化的发展[17]。Ghaznavi等[18]研究表明，CHD患者组较对照组ABCA1基因甲基化频率明显升高，提示ABCA1基因甲基化是冠状动脉疾病发展的重要危险因素。随着DNA甲基化研究的深入，近几年DNA羟甲基化的研究也逐步开展，Song等[19]研究发现，基因中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）富集程度与低氧环境下血管生成密切相关，TET蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5mC）变成5hmC的过程需要氧分子。Peng等[20]研究发现，TET2介导5mC转化5hmC，TET2的缺失与晚期动脉粥样硬化病变相关。5hmC通过调控DNA甲基化状态来活化抑制基因和凋亡基因，若5hmC水平降低则将因基因缺乏保护而致心脑血管疾病。大部分研究已显示5hmC参与了基因转录与表达的调控过程，同时也是去甲基化过程中的一个重要中间产物[21]。5hmC虽与包括心脑血管疾病在内的多种疾病密切相关，但5hmC具体作用机制尚未明确，随着检测技术的改进，5hmC有望成为疾病早期诊断新的表观遗传标志[22]。

2 冠心病血瘀证DNA甲基化/羟甲基化

CHD属中医学“胸痹”范畴，其病位在心，病机关键在于血脉瘀阻。血瘀证是CHD最常见的证型之一[23]。关于CHD血瘀证相关基因甲基化/羟甲基化的研究已有一定进展。陈光等[24]对CHD不稳定性心绞痛血瘀证和非血瘀证患者外周血细胞中白细胞介素-6（IL-6）基因启动子区甲基化状态分析发现，血瘀证组患者IL-6基因启动子甲基化水平高于非血瘀证组。唐梅森[25]研究发现，CHD血瘀证组患者ER-α和糖蛋白Ⅵ基因启动子甲基化阳性率高于CHD痰浊证和健康人组。许多研究表明，中医证候与DNA甲基化之间有着密切联系。本课题组也通过研究CHD血瘀证差异表达基因的甲基化表达谱芯片发现，ER-β、CHL1、ZEB2等8个基因启动子区甲基化状态CHD血瘀证与健康人比较差异有统计学意义[23，26-27]。现阶段中医与CHD证候本质间的研究正在逐步深入。中医证候本质是机体生物信号包括多个遗传基因网络的表达和通路调控的紊乱，但CHD血瘀证候的分子生物学本质还需进一步研究与探讨。

3 冠心病相关基因甲基化修饰中药调控分子生物学

现阶段，去甲基化药物研究还处在初级阶段，且尚未能去除或减轻去甲基化药物细胞的毒性，所以，研究中药调控CHD相关基因甲基化修饰，从而拮抗动脉粥样硬化的进一步发展，已成为目前研究焦点。

近年来，中药对动脉粥样硬化DNA甲基化的研究主要集中在中药复方[28]。如对中药影响DNA甲基化稳定粥样斑块的基础研究表明，联用血府逐瘀胶囊和四季三黄胶囊可增加整个基因组甲基化水平，从而降低体内三酞甘油的含量，使动脉内斑块的稳定性得以提高，这可能是其抗动脉粥样硬化作用的潜在机制，但具体机制还需进一步明确[29]。Wang等[30]研究发现，复方中药补肾宁心煎能抑制细胞黏附分子，增强内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性，提高雌激素受体β的表达，抑制单核细胞趋化蛋白-1的转录，进而缓解动脉粥样硬化的早期病理损伤，因此可更深入探讨补肾宁心煎能否通过调控甲基化作用来干预动脉粥样硬化的发生、发展。汤琛琛等[31]研究发现，中药对DNA甲基化诱导的心血管疾病有逆转作用，如姜黄素与DNA甲基化转移酶1（DNMT1）发生共价结合从而发挥抑制DNMT的作用，降低DNA甲基化水平。有学者亦发现，姜黄素可抑制血管平滑肌细胞的增殖，机制可能与上调DNMT2的表达而引起18S rRNA基因启动子甲基化有关[32]。在中药治疗CHD对DNA甲基化干预机制研究中发现，平肝潜阳方能升高血管平滑肌细胞的DNMT1，致使基因组整体高甲基化[33-34]。Zhou等[35]研究表明，栀子川芎胶囊可通过调节异常的高甲基化基因和低甲基化基因来治疗动脉粥样硬化，其改变的甲基化基因参与了蛋白激酶C的活性、炎性途径、MAPK信号传导途径、血管内皮生长因子信号传导途径等。尹伟娜[36]研究发现，复方中药通心络能通过抑制KLF5介导的小分子核糖核酸-155表达及影响外分泌包装蛋白LRP1和RAB27a表达来抑制动脉粥样硬化斑块的形成。任攀等[37]研究发现，当归芍药散可改善血脂水平、减少动脉粥样硬化斑块面积，具有明确的抗动脉粥样硬化作用，其机制可能与抑制血清甲基化水平和DNMTs水平、促进斑块体内PPARγ表达和抑制斑块内DNMT1表达有关。

上述研究均表明，中药可通过调节全基因甲基化水平或调节某些特定的基因干预CHD相关基因甲基化/羟甲基化修饰[33]。中医药在防治CHD中具有独特的优势，将表观遗传学及分子生物学技术引入中医药领域，不但可了解中医药的分子作用机制，还可为CHD临床治疗提供新方法。

4 冠心病血瘀证相关基因甲基化修饰中药调控分子生物学

血瘀证作为CHD最常见证型之一，其病因病机等已有深入的客观化研究，特别是随着基因组学研究的迅猛发展，把基因组学融入中医学在不断深入。中药是中医学中不可或缺的部分，通过中药影响和靶向调控CHD血瘀证的相关基因表达及甲基化修饰，从而影响或阻止血瘀证的发生和发展值得深入研究。

部分研究已表明，中药干预能调控CHD血瘀证相关基因的甲基化修饰，从而影响或阻止动脉粥样硬化的发展。如黄海波[38]临床研究发现，养心通脉方干预家系CHD血瘀证患者能使ZEB2基因的DNA甲基化的调控显著下降，影响动脉粥样硬化的发生发展，证明ZEB2基因与家系CHD血瘀证存在相关性，且养心通脉方对CHD血瘀证缓解期疗效更显著。程修平等[39]用稳斑汤联合西药对比单纯西药治疗急性冠脉综合征痰浊血瘀证患者，治疗组患者中医证候积分显著降低，临床疗效总有效率明显高于对照组，其作用机制可能与降低血浆血栓调节蛋白基因启动子甲基化水平相关。向忠军[27]研究发现，加减养心通脉方能对CHD血瘀证3个亚型的肌间线蛋白（DES）基因表达有明显的调控，进一步证实DES基因的甲基化修饰是CHD血瘀证的发病机制之一。

上述研究均表明CHD血瘀证与相关基因DNA异常甲基化水平相关，通过中药干预，能明显调控DNA的甲基化水平，通过单体化合物或化学成分群作用于DNA甲基化酶，从而逆转疾病导致的DNA异常甲基化。但现阶段通过中药干预探讨CHD血瘀证相关基因DNA甲基化改变的研究较少，中药对血瘀证易感基因的表观遗传调控机制还需更深入的研究。许多学者已观察到中医理论与DNA甲基化之间的关联，但揭示中药多靶点优势及中医理论科学性的关键在于是否中药作用强度和方式为多组分有序调控，是否能研究出血瘀证DNA甲基化改变的易感基因相对应的中药治疗方法敏感的标志物，是否能通过以方测证探讨CHD血瘀证的特异性调控基因。因此，单味中药及复方的活性组分调控DNA甲基化是否涉及中医特色治疗、外界环境因素对DNA甲基化调控基因表达的表观遗传调控机制等，仍需更深入的研究。

5 小结及展望

中医药对表观遗传学调控的研究尚处于早期和不成熟阶段。中医药表观遗传学不但阐述证候与相关DNA甲基化酶的关系，而且验证中药治疗可逆转DNA的异常甲基化。可遗传和可逆性是表观遗传学的两大特点，通过外部环境干预，可多方位、全面作用和调控遗传基因的功能和特性。这也与中医药治疗疾病时的全面性、多靶点性有相似之处。为使中医药和表观遗传学两者共同发展，需从中医药的思路和中药验方去探讨和发现表观遗传调控规律，使两学科发展相互促进，即以DNA甲基化作为CHD血瘀证新的诊疗工具，利用其修饰上的可逆性，通过中药外界环境干预手段寻找到有效的干预或调控靶点，将为中医证候本质研究提供一个新的突破点和方向标。

总之，CHD血瘀证相关基因甲基化/羟甲基化修饰的调控机制还需更深入的研究和探讨，以方测证，从一些CHD血瘀证候选基因DNA甲基化/羟甲基化入手，找到其相关生物通络作用，从基因表达-中药干预的系统生物学角度来把握CHD基因的表观遗传与临床应用结合点，以期发现中药对CHD血瘀证甲基化/羟甲基化修饰的调控机制，阐明中药干预CHD血瘀证的主要危险基因表达的调控靶点，为中医药预防和促进CHD血瘀证的临床治疗提供新思路。

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Research Progress in Molecular Biology of TCM Regulating Coronary Heart Disease with Blood Stasis Syndrome-related Genes Based on DNA Methylation/Hydroxymethylation Levels

ZHANG Shumeng, CHEN Lingli, ZHANG Xiangzhuo, ZENG Xueqin, ZHANG Mengxue, LI Xianfu, JIANG Yujie, LI Jie

Coronary heart disease is a complex disease with multi-gene heredity and environmental factors. Blood stasis syndrome is one of the common syndromes. Epigenetics is currently a hotspot in the field of cardiovascular research. Epigenetic mechanisms can explain the interaction between genes and the environment. The occurrence and development of coronary heart disease is closely related to the abnormal methylation of DNA, while modifications are reversible. This article used DNA methylation as a new diagnosis and treatment tool of coronary heart disease with blood stasis syndrome, discussed the research progress of regulating the gene hydroxymethylation modification of coronary heart disease with blood stasis syndrome through TCM intervention, and also provided a new thoughts for the study of TCM syndrome essence.

coronary heart disease; blood stasis syndrome; TCM intervention; DNA methylation; DNA hydroxymethylation; review

R2-05；R259.433

A

1005-5304(2020)11-0141-04

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005437

国家自然科学基金（81673963、81874375）；湖南省自然科学基金（2018JJ2298）；湖南省教育厅重点项目（16A160）；湖南省教育厅科研项目重点项目（60011120）；湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金（2018ZXYJH23）

李杰，E-mail：317768870@qq.com

（2020-05-24）

（2020-06-01；编辑：华强）