不同灸法对环磷酰胺所致免疫抑制兔脾组织程序性死亡因子-1及其配体表达的影响

王旭，孙妮娜，田岳凤，翟春涛，单增天，吴爱花

不同灸法对环磷酰胺所致免疫抑制兔脾组织程序性死亡因子-1及其配体表达的影响

王旭1，孙妮娜2，田岳凤2，翟春涛2，单增天2，吴爱花2

1.山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619；2.山西中医药大学，山西 晋中 030619

观察不同灸法对环磷酰胺所致免疫抑制兔脾组织程序性死亡因子-1（PD-1）及其配体PD-L1表达的影响。大耳白兔32只随机分为空白组、模型组、隔药饼灸组、艾灸组。除空白组外，其余3组腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制兔模型，连续7 d。成模后，隔药饼灸组和艾灸组分别给予隔药饼灸、艾灸干预，隔日灸，共灸10次。治疗结束后次日动物麻醉，摘取脾脏。采用RT-qPCR检测PD-1、PD-L1 mRNA表达，免疫组化检测PD-1蛋白表达。与空白组比较，模型组兔脾组织PD-1、PD-L1 mRNA表达明显升高（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组兔脾组织PD-1、PD-L1 mRNA表达明显降低（＜0.01），艾灸组兔脾组织PD-L1 mRNA表达明显降低（＜0.05），PD-1 mRNA表达虽有降低趋势但差异无统计学意义（＞0.05）。免疫组化结果显示，兔脾组织棕褐色PD-1阳性表达主要在细胞浆、细胞膜或间质，与空白组比较，模型组兔脾组织PD-1蛋白表达显著升高（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组和艾灸组兔脾组织PD-1蛋白表达显著降低（＜0.01，＜0.05）。不同灸法对免疫抑制兔免疫功能均有明显改善作用，隔药饼灸较艾灸更具优势。

灸法；程序性死亡因子-1；程序性死亡因子-1配体；环磷酰胺；免疫抑制；兔

程序性死亡因子-1（PD-1）及其配体（PD-L1）于1992年由Ishida等[1]提出，最初发现于凋亡的T细胞杂交瘤，是一种广泛存在于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞表面的受体。PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成员之一，PD-L1为其配体。PD-1作为一种重要的免疫抑制分子，在维持淋巴细胞稳态方面起关键作用。课题组前期研究显示，不同灸法对环磷酰胺所致免疫抑制兔血细胞、免疫球蛋白、补体、免疫细胞、免疫因子及免疫器官均有明显的调节作用，且隔药饼灸改善上述指标的作用优于艾灸[2]。本实验在前期研究的基础上，采用RT-qPCR和免疫组化方法观察隔药饼灸、艾灸对免疫抑制兔脾组织共刺激分子PD-1、PD-L1表达的影响，并对两种灸法的作用进行比较。

1 实验材料

1.1 动物

大耳白兔40只，体质量（2.5±0.3）kg，雌雄各半，北京昌扬西山养殖场提供，动物许可证号SCXK（京）2011-0010。饲养于温度18～25 ℃、相对湿度50%～70%环境，自由摄食饮水，分笼饲养7 d。

1.2 艾条、主要试剂和仪器

18 mm×200 mm艾条、艾绒，江苏盱眙华佗中药厂。cDNA第一链合成试剂盒，立陶宛Fermentas，批号K1622；15596-026Trizol，美国Invitrogen；QPK201Real-time PCR Master Mix（SYBR Green），日本Toyobo；XW-80A涡旋振荡器，海门其林贝尔；Centrifuge 5804R高速冷冻离心机，法国Eppendorf；UV-2450紫外光度仪，日本Shimadzu；MultiGene Gradient PCR循环仪，美国Labnet；DA7600荧光定量PCR循环仪，中山达安；DYY-6B核酸电泳仪，北京六一；Gel Doc XR凝胶成像仪，美国Bio-Rad； Histocentre 3型石蜡包埋机，英国Shandon；Finesse 325型石蜡切片机，英国Shandon；Excelsior型全自动组织脱水机，英国Shandon；H550L显微镜，日本尼康；配套电子显微镜DS-Fi3，配套图像处理软件NIS-Elements，日本尼康。

2 实验方法

2.1 分组及造模

大耳白兔40只随机分为空白组、模型组、隔药饼灸组、艾灸组，每组10只。适应性饲养1周后，除空白组外，其余各组参照文献[2]方法造模，经课题组改良后按60 mg/kg腹腔注射环磷酰胺（山西普德药业股份有限公司，批号20180802）制备免疫抑制兔模型，即每日上午腹腔注射环磷酰胺（用生理盐水稀释），每日1次，连续7 d。以动物出现精神状态差、饮食少、有脱毛现象及血白细胞计数明显降低为造模成功的标志。空白组每日给予等量生理盐水腹腔注射。最终以每组8只动物进入统计分析。

2.2 干预

①穴位选择：神阙、关元、足三里（双）、脾俞（双）、肾俞（双），定位参照《实验针灸学》[3]常用动物穴位定位法及拟人比照法。②药饼制作：以六味地黄汤原方比例组方（熟地黄∶山萸肉∶山药∶泽泻∶牡丹皮∶茯苓＝8∶4∶4∶3∶3∶3），饮片购自山西同仁堂大药房，使用时按上述比例打碎成粉末，过120目筛备用，临用前以温水调匀，用模具制成直径1 cm、厚0.3 cm药饼。③施灸方法：造模结束后次日，隔药饼灸组和艾灸组每日上午施灸治疗。动物穴位处剪毛，绑缚固定于兔台。隔药饼灸组用艾柱模型将艾绒制成底径0.8 cm、高0.5 cm大小相等的圆锥形艾柱，置于药饼上，以线香点燃，燃尽更换，每穴连灸5壮，隔日灸，共灸10次；艾灸组将与5壮艾柱的等量艾绒用卷烟器制作成小艾条，置于自制艾灸架上，在穴位上方约2～3 cm处施灸，隔日灸，共灸10次。④取材：治疗结束后第2日，动物腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘取脾脏，置于生理盐水中漂洗，滤纸吸干，称重；取部分脾脏中段组织置于液氮中，用于RT-qPCR检测；取部分脾脏中段组织放入10%福尔马林中固定保存，用于免疫组化观察。

2.3 指标检测

2.3.1 实时荧光定量PCR检测

RNA提取：取适量样品置于冰冷组织匀浆器中，加入1 mL冰冷的Trizol，冰上研磨至无颗粒状澄清液，移至1.5 mL离心管，室温放置5 min；加入氯仿，振荡15 s，室温静置3 min；4 ℃、12 000×离心15 min，取上清液至另一离心管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min；4 ℃、12 000×离心10 min，弃上清，加75%乙醇1 mL，轻轻混匀。室温干燥沉淀约5 min，加入30～50 μL无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后置于-70 ℃冰箱保存。RNA浓度和纯度测定：取RNA样品用1×TE Buffer稀释样品100倍，测定260 nm和280 nm处吸光度，确定RNA质量，计算RNA浓度，OD260/OD280均在1.8～2.1。cDNA第一链合成（20 μL体系）；为减少干扰，每个cDNA样本稀释10倍（5 μL cDNA＋45 μL H2O），引物F和R均在同一管中，浓度均为10 μmol/L。兔脾脏分组处理，RT-qPCR检测样品基因的表达，实验重复3次，所得数据用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp PD1F：CACTGCTGCTGTGCTTGTC146 R：CTGGTGCTCCCTGGTCTACT PD-L1F：TGGATCCAGTCACCTCTGAA138 R：ACTTCTCCTCTCGGTTGGAA GAPDHF：AAGGTCATCCACGACCACTT145 R：AGGCAGGGATGATGTTCTG

2.3.2 免疫组化检测

取脾脏组织中段2 cm×1 cm×1 cm置于10%福尔马林中固定，石蜡包埋，切片。采用显微摄像系统进行图像采集，根据表达情况及组织大小分别采集5个区域图像；应用图像分析系统Image-Pro Plus6.0测定所采集全部图像的平均光密度，每张切片采集5张，取其平均值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 不同灸法对模型兔脾组织PD-1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组兔脾组织PD-1 mRNA表达明显升高（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组兔脾组织PD-1 mRNA表达明显降低（＜0.01），艾灸组兔脾组织PD-1 mRNA表达有所降低，但差异无统计学意义（＞0.05）；与艾灸组比较，隔药饼灸组兔脾组织PD-1 mRNA表达有所下降，但差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表2。

表2 各组兔脾组织PD-1 mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，**＜0.01；与模型组比较，##＜0.01

4.2 不同灸法对模型兔脾组织PD-L1 mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组兔脾组织PD-L1 mRNA表达明显升高（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组和艾灸组兔脾组织PD-L1 mRNA表达明显降低，（＜0.01，＜0.05）；与艾灸组比较，隔药饼灸组兔脾组织PD-1 mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表3。

表3 各组兔脾组织PD-L1 mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，**＜0.01；与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

4.3 不同灸法对模型兔脾组织PD-1蛋白表达的影响

免疫组化染色显示，兔脾组织棕褐色PD-1阳性表达主要在细胞浆、细胞膜或间质，见图1。与空白组比较，模型组兔脾组织PD-1蛋白表达显著升高，（＜0.01）；与模型组比较，隔药饼灸组和艾灸组兔脾组织PD-1蛋白表达明显降低（＜0.01，＜0.05）；与艾灸组比较，隔药饼灸组兔脾组织PD-1蛋白表达有所下降，但差异无统计学意义（＞0.05），见表4。

图1 各组兔脾组织PD-1阳性表达（免疫组化染色，×400）

表4 各组兔脾组织PD-1蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，**＜0.01；与模型组比较，#＜0.05，##＜0.01

5 讨论

PD-1属CD28家族分子，为免疫细胞的抑制性共刺激分子，对免疫细胞的功能有着重要的负性调控作用。PD-1及其配体PD-L1的组织分布特点及所传递的抑制信号，在抗原特异性T细胞的活化、增殖及效应过程中有重要作用。研究表明，PD-1在T细胞受到刺激后数小时内可表达于激活的T细胞表面，而静止期的T细胞不表达PD-1[4]。PD-1和PD-L1信号通路具有维持外围正常免疫效应的作用，PD-1以不同的亲和力与其配体PD-L1和PD-L2结合。

中医药调节机体免疫功能具有整体性、平衡性、多系统和多靶点特点，可改善机体内环境，使机体处于阴阳平衡状态。隔药饼灸是集药物、穴位、艾灸三者作用为一体的一种独特艾灸治疗方法，它借助艾绒易于燃烧，火力温和，热力具有穿透皮肤、直达组织深部的特点，使所隔药物透皮吸收，减少对胃肠道的刺激。本研究所用药物为经方六味地黄汤，方中熟地黄滋补肝肾、益精填髓，山萸肉补益肝肾，山药补脾益肾，三药配合，肝、脾、肾三阴并补，以补肝肾为主；茯苓健脾燥湿、利水渗湿，泽泻利湿泄浊，牡丹皮清泄虚热，三药配合泻肝脾肾。全方有开合之妙，补中有泻、泻中有补，补而不腻，泻不伤正。研究表明，六味地黄汤组成药物及成方均含有提高或调节机体免疫功能的活性物质，可调节机体的免疫功能[5]。

在穴位选择上，本研究选用脾俞、肾俞、神阙、足三里、关元，均为传统保健要穴。脾俞和肾俞为背俞穴，具有调补脾肾之气之功，二穴同用可补肾滋阴、健脾益气，增强先后天之本。足三里为足阳明胃经合穴，是强身保健、延年益寿的要穴。神阙属任脉，为真气所承，是“五脏六腑之本，冲脉循行之地，元气归藏之根”，具有养生保健、延年益寿、温补元阳、健运脾胃、复苏固脱之功效。关元为足三阴经、任脉之会，小肠之募穴，为先天之原气与元阴元阳交关之所，有温肾固精、补气回阳、通调冲任、理气和血之功效。本实验结果显示，艾灸“关元”“足三里”“脾俞”等穴可改善胃肿瘤大鼠一般状况和荷瘤生存状态，明显提高荷瘤大鼠胸腺、脾脏指数及外周血CD3-CD161+NK和CD3+CD161+NKT含量，改善大鼠生存状态，其调控机制与强化机体非特异性抗肿瘤免疫相关[6]。艾灸“肾俞”“足三里”可通过降低类风湿关节炎大鼠血清白细胞介素-6含量，抑制免疫细胞分化产生相关炎症因子，控制类风湿关节炎的发展[7]。不同灸量隔药饼灸“脾俞”“肾俞”“足三里”“关元”“神阙”可改善环磷酰胺所致兔免疫功能低下，且不同灸量效果有一定差异[8]。临床研究表明，化脓灸足三里治疗中晚期结肠癌患者，可通过调节外周血T细胞亚群中CD4+、CD8+含量，降低血清转化生长因子-β1水平，提高机体的免疫功能，从而提高其生活质量[9]。艾灸肾俞、关元治疗可通过改善运动员红细胞免疫功能和T细胞亚群功能异常，提高其机体免疫力[10]。

PD-1及其配体作为近年研究体内免疫反应重要分子的负性调节因子，其信号通路可诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用。研究发现，采用腹腔注射环磷酰胺制备免疫抑制小鼠模型，其PD-1 mRNA处于高表达状态，给予云芝多糖肽治疗后PD-1 mRNA表达显著降低，表明云芝糖肽可能通过下调环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠脾脏组织免疫负调控分子PD-1 mRNA表达而发挥免疫增强作用[11]。还有研究用黄芪、金银花、野菊花、鬼针草、半枝莲组成中药复方提取液，采用RT-PCR检测脾脏PD-1/PD-L1的表达，随着中药提取液浓度的增加，脾脏淋巴细胞PD-1表达显著降低，而PD-L1 mRNA表达无显著变化，表明中药复方能抑制淋巴细胞PD-1的表达[12]。此外，有研究表明，黄芪提取物黄芪多糖能抑制荷瘤小鼠脾组织PD-1 mRNA的表达，而PD-L1 mRNA表达无显著变化[13]。本研究发现，空白组兔脾组织PD-1、PD-L1 mRNA呈低水平表达，注射环磷酰胺造成免疫抑制模型后，均表现出高表达；经干预后，隔药饼灸组较模型组PD-1、PD-L1 mRNA表达均明显降低；艾灸组PD-1 mRNA表达与模型组比较差异无统计学意义，PD-L1 mRNA表达较模型组差异显著。作为配体的PD-L1 mRNA的表达较PD-1 mRNA的表达显著，可能与T细胞的免疫活化有关。

PD-1属免疫球蛋白超家族成员，其以单体形式存在于细胞表面，正常人淋巴组织生发中心中T淋巴细胞表面可检测到PD-1的表达，PD-L1通常表达于肿瘤细胞表面，也表达在T细胞和B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和骨髓来源的肥大细胞等。刘敏龙等[14]通过观察脓毒症小鼠脾脏PD-L1表达，发现采用盲肠结扎穿孔法造模小鼠脾脏PD-L1阳性细胞出现在红髓和脾小体，且24 h和48 h单核细胞PD-L1的表达均较假手术组升高，表明脓毒症小鼠脾脏PD-L1表达可能参与脓毒症发生发展。临床研究发现，PD-1和PD-L1鼻咽癌及鼻咽部正常黏膜组织中均有表达，但在鼻咽癌组织中的表达均异常升高，高于正常组织；PD-1阳性表达主要位于细胞核和/或细胞浆中，与患者年龄、性别、病理类型、分期及淋巴结转移无关，与吸烟有关；PD-L1主要表达场所位于细胞浆中，与患者性别、吸烟、病理类型及淋巴结转移无关，与年龄及分期有关[15]。研究还发现，PD-1在食管癌患者正常组织中均未见表达，PD-1和PD-L1在癌组织和癌旁组织中均呈阳性表达，且有远处转移的食管癌PD-L1高表达率明显高于无远处转移的食管癌[16]。还有研究发现，急性肾移植排斥肾组织PD-1/PD-L1的表达，急性肾移植排斥肾组织PD-L1、PD-1较正常组增多、增强，其小管PD-L1阳性强度与肾间质PD-1阳性细胞数呈正相关，与小管间质病理损害程度呈负相关，表明PD-L1/PD-1信号通路在急性肾移植排斥肾小管间质病理损害中起重要作用[17]。本研究结果显示，兔脾组织棕褐色PD-1阳性表达主要在细胞浆、细胞膜或间质，且模型组兔脾组织PD-1蛋白表达较空白组显著升高；经干预后，隔药饼灸组和艾灸组兔脾组织蛋白表达均明显降低，但隔药饼组与艾灸组蛋白表达比较差异不明显。

综上，兔脾组织棕褐色PD-1阳性表达主要在细胞浆、细胞膜或间质，隔药饼灸和艾灸均可降低兔脾组织PD-1蛋白表达。隔药饼灸可降低脾组织PD-1、PD-L1 mRNA表达，而艾灸虽能抑制PD-1、PD-L1 mRNA的表达，但对PD-1 mRNA的表达抑制程度不明显。可见，不同灸法对免疫抑制兔免疫功能均有明显的改善作用，隔药饼灸较艾灸更具优势。此项观察是基于前期不同灸法对机体免疫功能调节作用研究开展的，后续将在此基础上围绕PD-1及PD-L1通路对T细胞、B细胞的免疫活化、免疫耐受等进行更深层次的研究。

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Effects of Different Types of Moxibustion on Expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in Immunosuppressive Rabbits Induced by Cyclophosphamide

WANG Xu1, SUN Nina2, TIAN Yuefeng2, ZHAI Chuntao2, SHAN Zengtian2, WU Aihua2

To observe the changes of expressions of PD-1 and PD-L1 in immunosuppressive rabbits induced by cyclophosphamide through different types of moxibustion.Totally thirty-two rabbits were randomly divided into blank group, model group, herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group. Except the blank group, the other three groups were intraperitoneally injected with cyclophosphamide to make immunosuppressive rabbit model for 7 days. After the model was established, herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group were treated with herbal cake-separated moxibustion and directed-moxibustion respectively, once every other day, 10 times in total. The next day after the treatment, the animals were anesthetized and the spleen was removed. The expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the expression of PD-1 protein was detected by immunohistochemistry.Compared with the blank group, the expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the model group increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the expressions of PD-1 and PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the rabbits in the herbal cake-separated moxibustion group was significantly lower (<0.01), and the expression of PD-L1 mRNA in the spleen tissue of the moxibustion group was significantly lower (<0.05), while the PD-1 mRNA showed a decreasing trend, without statistical significance (>0.05). Immunohistochemical results showed that the positive expression of PD-1 in rabbit spleen tissue was mainly in the cytoplasm, cell membrane or interstitial. Compared with the blank group, the expression of PD-1 protein in the rabbit spleen tissue of the model group significantly increased (<0.01). Compared with the model group, the expression of PD-1 protein in the spleen tissues of rabbits in the herbal cake-separated moxibustion group and moxibustion group was significantly reduced (<0.01,<0.05).Different types of moxibustion have obviously improved the immune function of immunosuppressive rabbits, and herbal cake-separated moxibustion has more advantages than moxa moxibustion.

moxibustion; PD-1; PD-L1; cyclophosphamide; immunosuppressive; rabbits

R245

A

1005-5304(2020)11-0066-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007162

国家自然科学基金（81674062）

田岳凤，E-mail：tyfsx@163.com

（2020-07-09）

（2020-07-29；编辑：华强）