复方七芍降压片对TNF-α诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞P2Y6信号通路相关因子表达的影响

刘叶倩，李弘，龚姗，陈春茗，马丹凤，刘林，王志琪，曾勇，王宇红，任卫琼

复方七芍降压片对TNF-α诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞P2Y6信号通路相关因子表达的影响

刘叶倩1，李弘1，龚姗1，陈春茗1，马丹凤2，刘林1，王志琪3，曾勇1，王宇红4，任卫琼1

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南省儿童医院，湖南 长沙 410006；3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学科技创新中心，湖南 长沙 410208

观察复方七芍降压片对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的与平滑肌细胞共培养的血管内皮细胞中炎症因子与P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达的影响，探讨其治疗高血压的机制。采用内皮细胞和平滑肌细胞构建共培养体系，利用炎症因子TNF-α建立高血压炎症微环境。将共培养好的细胞随机分为正常组、模型组、空白血清组、MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组、MRS2578＋复方七芍药物血清组。MRS2578组和MRS2578＋复方七芍药物血清组加入10 μmol/L MRS2578。正常组和模型组加入等量培养液，余各组加入10%药物血清及空白血清。采用倒置显微镜观察内皮细胞和平滑肌细胞形态；采用ELISA检测细胞上清液炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-10水平；采用免疫荧光、Western blot、RT-qPCR技术检测内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的表达。与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞和平滑肌细胞数量明显减少，细胞轮廓不清晰，折光性降低，漂浮的死细胞团块增多；IL-1β含量显著增加，IL-10含量显著减少（＜0.01）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度、灰度值、mRNA水平明显升高（＜0.01）。与模型组比较，复方七芍药物血清组内皮细胞和平滑肌细胞折光性增强，细胞形态恢复正常；IL-1β水平明显降低（＜0.05）；P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度、灰度值、mRNA水平明显降低（＜0.01）。复方七芍降压片可明显调控TNF-α诱导的内皮炎症反应，改善内皮炎症导致的平滑肌细胞损伤，维持其正常功能，其机制可能与调控内皮细胞P2Y6受体及其下游信号通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表达，改善炎症反应有关。

复方七芍降压片；内皮细胞；平滑肌细胞；P2Y6-MEK1/2-ERK1/2；炎症反应；血管重塑；大鼠

血管重塑是高血压病最显著的病理性特征，是引发其他靶器官损伤的共同病理基础，也是高血压致死的重要危险因素。高血压作为一种慢性炎症性疾病，炎症在高血压的发展进程及血管重塑的形成中扮演着极其重要的角色。嘌呤受体P2Y6是一种炎性诱导性蛋白，参与调控血管内皮炎症反应[1]。酪氨酸激酶受体1/2（MEK1/2）、丝裂原活化蛋白激酶1/2（ERK1/2）作为促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的重要组成部分，在细胞增殖与分化过程中发挥着重要的作用[2-3]。有研究表明，炎性受体P2Y6广泛分布于内皮细胞、平滑肌细胞、小胶质细胞等细胞中[4]，其激活后可上调MEK1/2磷酸化水平，激活ERK1/2通路，促进炎症因子释放，导致内皮炎症反应的发生[5]。炎症损伤内皮细胞后，内皮功能受损，进一步加剧炎症反应，引起平滑肌细胞损伤，出现增殖、肥大、迁移、紊乱现象，导致血管重塑。这些证据表明，P2Y6受体介导的内皮炎症反应可能是调控血管重塑的重要机制之一。

复方七芍降压片具有养阴柔肝、化瘀熄风功效，为湖南中医药大学第一附属医院治疗肝肾阴虚、阴虚阳亢型高血压的经验方。本课题组前期研究表明，该方可通过逆转血管重塑，发挥良好的降压作用[6]，但其作用机制是否与内皮细胞中P2Y6受体相关尚不明确。本实验以内皮细胞和平滑肌细胞共培养体系为研究对象，探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的炎症反应状态下内皮细胞P2Y6受体相关信号通路活化状态与血管平滑肌细胞损伤的相关性，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物和细胞

雄性SD大鼠15只，SPF级，体质量230～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号43004700048755，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。大鼠饲养于SPF级动物房，温度22～25 ℃、湿度50%，适应性喂养7 d。原代大鼠血管内皮细胞株（CP-R075）、平滑肌细胞株（CP-R076），Procell公司。

1.2 药物

复方七芍降压片（三七6 g、白芍10 g、丹参12 g、天麻10 g、葛根10 g、桑寄生10 g、杜仲10 g、甘草3 g等），湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备，批号20181026，规格0.46 g/片，人临床日用量为12片，相当于原药材97 g，蒸馏水稀释备用；厄贝沙坦片，扬子江药业集团北京海燕药业有限公司，批号17122111，规格75 mg/片，成人临床日用量为300 mg，蒸馏水稀释备用。MRS2578，美国Selleck公司，批号S285501。

1.3 主要试剂与仪器

MEK1/2（00045687）一抗，Proteintech试剂公司；P2Y6（GR209076-11）、ERK1/2（AH10223489）、β-actin内参抗体（AH11286487）、山羊抗兔HRP二抗（AH11279138），北京博奥森生物技术有限公司；1L-1β（20190305）、IL-10（20190305）ELISA试剂盒，上海晶天生物科技有限公司；内皮细胞培养基（WH01111906SP），Procell公司。mini protean 3 cell电泳仪（BIO-RAD），MK3型酶标仪（芬兰雷勃），K30型干式恒温器（杭州爽盛仪器），Centrifuge 5424 R型离心机（德国Eppendorf），HI1210型水浴锅（Leica），BCD-196TMZL型冰箱（青岛Haier），Tanon-5200型全自动化学发光分析（上海天能），ULUPURE型优普特实验室超纯水（法国Millipore）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将原代内皮细胞和平滑肌细胞分别置于37 ℃、5%CO2专用培养液中培养，隔日换液，0.25%胰酶消化传代，调整细胞密度为1×106～5×106个/mL，按条件培养基不同分别转种于培养瓶，用于后续实验。

2.2 共培养体系建立

将处于对数生长期内皮细胞和平滑肌细胞用0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×106～5×106个/mL；将内皮细胞接种至Transwell小室孔板底部，平滑肌细胞接种至Transwell小室内侧，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内共培养1～2 d，即可成功构建内皮细胞和平滑肌细胞共培养体系[4]。

2.3 分组和给药

共培养体系成功建立后，加入10 ng/mL TNF-α干预24 h，构建模拟高血压炎症微环境。并随机分为正常组（内皮细胞＋平滑肌细胞）、模型组（内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子）、空白血清组（内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子＋空白血清）、MRS2578组（沉默内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子）、厄贝沙坦药物血清组（内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子＋厄贝沙坦片血清）、复方七芍药物血清组（内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子＋复方七芍降压片血清）和MRS2578＋复方七芍药物血清组（沉默内皮细胞＋平滑肌细胞＋炎症因子＋复方七芍降压片血清）。MRS2578组和MRS2578＋复方七芍药物血清组加入10 μmol/L MRS2578。正常组和模型组加入等量培养液，其余各组加入10%药物血清及空白血清。取实验大鼠15只，按体质量随机分为厄贝沙坦组、复方七芍降压片组和空白组，每组5只，分别灌胃给予临床等效剂量3倍的厄贝沙坦片（0.081 g/kg）、复方七芍降压片（1.50 g/kg）和等体积蒸馏水，给药体积10 mL/kg，每日2次，连续3 d。末次给药后2 h，腹主动脉取血，4500 r/min离心10 min，取上清液，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，即得厄贝沙坦片血清、复方七芍降压片血清及空白血清，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 细胞形态观察

造模干预及药物处理24 h后，倒置显微镜观察平滑肌细胞、内皮细胞形态。

2.5 细胞上清液炎症因子白细胞介素-1β、白细胞介素-10水平检测

造模干预及药物处理24 h后，收集细胞上清液，3000 r/min离心15 min，取上清液，ELISA检测IL-1β、IL-10水平，严格按照试剂盒说明书操作。

2.6 免疫荧光检测内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达

取培养好的细胞，移去孔内液体，冷PBS润洗2次，4%多聚甲醛固定30 min、0.25%Triton-10作用15 min及5%BSA封闭10 min后，分别加入兔抗大鼠P2Y6、MEK1/2、ERK1/2一抗稀释液（体积比均为1∶100），4 ℃避光孵育过夜，弃液，冷PBS润洗4次。加入FITC标记的山羊抗兔二抗稀释液（体积比均为1∶400），37 ℃避光孵育30 min，弃液，冷PBS润洗4次。加入DAPI工作液，室温避光孵育15 min，弃液，冷PBS润洗4次，最后进行荧光检测并拍照，并以平均荧光强度值反映各蛋白相对表达水平。

2.7 Western blot检测内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达

从RIPA细胞裂解物中提取细胞总蛋白。用BCA法检测蛋白含量，按4∶1比例加入5×SDS上样缓冲液，配制10%SDS-PAGE胶电泳并转膜至PVDF膜上（90 V，50 min），封闭液（5%脱脂奶粉）水平摇床封闭2 h，加入P2Y6、MEK1/2、ERK1/2抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜，将孵育好一抗的PVDF膜用PBST洗涤3次，5 min/次。二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，PBS洗涤后，ECL发光、显影。TANON GIS软件读取各目的蛋白的条带灰度值，以β-actin为内参计算其相对表达量。

2.8 实时荧光定量PCR检测内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达

收集各组内皮细胞样本，PBS漂洗3次，加入适量Trizol，充分混匀后，室温静置5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液置于离心管；再移取200 μL氯仿溶液加入上清液，混匀后，涡旋15 s，离心，取上清液加入等体积异丙醇溶液，离心后留取离心管底部RNA沉淀，加入75%乙醇，离心，丢弃上清液，RNA沉淀干燥后加入20 μL RNase-free溶液，得各组mRNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增。通过Primer 5.0软件设计引物，引物序列见表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp P2Y6F：CGGTCATCGGCTTCTTGCTTCC120 R：CCTTGCTGCGACGCTCTTGG MEK1/2F：CAAGAAGAAGCCGACGCCCATC124 R：GTCCAGCTCCAGCTCCTCCAG ERK1/2F：GGGAGGTGGAGGTGGTGAAGG100 R：GCTGAGCTGACCATGCCGTAC β-actinF：CCCAGGCATTGCTGACAGGATG144 R：TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

3 统计学方法

4 结果

4.1 复方七芍降压片对内皮细胞和平滑肌细胞形态的影响

与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞和平滑肌细胞数量明显减少，细胞轮廓不清晰，折光性降低，漂浮的死细胞团块增多；与模型组比较，MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞和平滑肌细胞数量不同程度增加，且内皮细胞呈典型铺路石样，平滑肌细胞梭形形态恢复，折光性增强，漂浮的死细胞显著减少，其中尤以复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组改善作用最明显。结果见图1、图2。

4.2 复方七芍降压片对细胞上清液炎症因子白细胞介素-1β、白细胞介素-10水平的影响

与正常组比较，模型组和空白血清组细胞上清液IL-1β水平显著升高（＜0.01），IL-10水平明显降低（＜0.01），表明TNF-α干预构建炎症微环境后造成促炎因子IL-1β分泌增加，抗炎因子IL-10分泌减少；与模型组比较，MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组IL-1β水平明显降低（＜0.05，＜0.01），MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、MRS2578＋复方七芍药物血清组细胞上清液IL-10水平明显升高（＜0.01）；与MRS2578组比较，MRS2578＋复方七芍药物血清组IL-1β水平明显降低（＜0.05），IL-10水平升高（＞0.05）。提示MRS2578和复方七芍降压片药物血清均能显著抑制炎症微环境损伤后细胞炎症因子IL-1β分泌增加及IL-10分泌减少，且两者合用效果更佳。结果见图3。

注：C.正常组；M.模型组；Q.空白血清组；R.MRS2578组；Y.厄贝沙坦药物血清组；Z.复方七芍药物血清组；ZR. MRS2578＋复方七芍药物血清组；与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与MRS2578组比较，#P＜0.05

4.3 复方七芍降压片对内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达的影响

免疫荧光结果显示，与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度明显升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2荧光强度明显降低，MRS2578组、MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞ERK1/2荧光强度明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与MRS2578组比较，MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2荧光强度降低，但差异无统计学意义（＞0.05）。提示复方七芍降压片药物血清在一定程度上能抑制炎症因子诱导的内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的高表达。结果见图4～图7。

Western blot结果显示，与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、ERK1/2蛋白表达显著降低（＜0.01），厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组内皮细胞MEK1/2蛋白表达均有降低，差异无统计学意义（＞0.05），MRS2578组、MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞MEK1/2灰度值均明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与MRS2578组比较，MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、ERK1/2蛋白表达均有降低，差异无统计学意义（＞0.05），MEK1/2蛋白表达明显降低（＜0.01）。表明复方七芍降压片药物血清对炎症因子诱导的内皮细胞损伤有不同程度的保护作用，且与MRS2578合用时效果更佳。结果见图8、图9。

注：C.正常组；M.模型组；Q.空白血清组；R. MRS2578组；Y.厄贝沙坦药物血清组；Z.复方七芍药物血清组；ZR. MRS2578＋复方七芍药物血清组；与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01

注：C.正常组；M.模型组；Q.空白血清组；R. MRS2578组；Y.厄贝沙坦药物血清组；Z.复方七芍药物血清组；ZR. MRS2578＋复方七芍药物血清组

注：C.正常组；M.模型组；Q.空白血清组；R. MRS2578组；Y.厄贝沙坦药物血清组；Z.复方七芍药物血清组；ZR. MRS2578＋复方七芍药物血清组；与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与MRS2578组比较，##P＜0.01

4.4 复方七芍降压片对内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达均明显升高，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，MRS2578组、厄贝沙坦药物血清组、复方七芍药物血清组和MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）；与MRS2578组比较，MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6、ERK1/2 mRNA表达降低，差异无统计学意义（＞0.05），MEK1/2 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（＜0.01）。表明复方七芍降压片在一定程度上能抑制P2Y6、MEK1/2、ERK1/2的mRNA表达，结果见图10。

注：C.正常组；M.模型组；Q.空白血清组；R. MRS2578组；Y.厄贝沙坦药物血清组；Z.复方七芍药物血清组；ZR. MRS2578＋复方七芍药物血清组；与正常组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与MRS2578组比较，##P＜0.01

5 讨论

高血压病属中医学“眩晕”“头痛”等范畴。其病机为本虚标实，以虚证居多，责之肝肾。肾阴亏虚，肝失濡养，虚火上扰，水不涵木，阴不维阳，阴虚阳亢，肝风扰动，发为眩晕。故治以养阴柔肝、化瘀熄风之法。复方七芍降压片以三七、白芍活血化瘀、养阴柔肝，桑寄生、杜仲补肾养肝，丹参、天麻、地龙活血熄风通络，萝芙木、葛根清热生津，炒香附疏肝理气，甘草调和诸药，全方共奏养阴柔肝、化瘀熄风之功。现代药理研究表明，三七、丹参具有舒张血管、降低外周阻力、改善微循环作用；天麻、地龙具有降低血浆中血管紧张素含量、减少血管活性物质分泌、调控血管紧张素-醛固酮系统功能；白芍、桑寄生、杜仲、萝芙木、葛根可缓解平滑肌痉挛，改善血管内皮依赖性舒缩失衡，防治血管重构[7-9]。

平滑肌细胞和内皮细胞是血管壁的重要组成部分，共同维持血管正常功能，与高血压血管重塑密切相关。平滑肌细胞是内皮细胞的周细胞之一，两者以隙缝连接方式相互调节[10]，其中平滑肌细胞受损、增殖是导致血管重塑的重要病理过程[11]；而内皮细胞可通过分泌多种细胞因子刺激平滑肌细胞增殖、迁移，致使细胞基质中胶原纤维增多，参与心血管疾病的血管重塑[5]。正常情况下血管平滑肌处于一种静息状态，当炎症因子、氧自由基等刺激因子导致内皮功能受损时，容易打破这种状态，导致多种细胞因子、血管活性物质紊乱，引起血管平滑肌细胞结构、功能发生改变[12]。郭庶等[13]研究发现，内皮功能损伤时会引起TNF-α、IL-6等炎症因子水平上调，激活平滑肌细胞中黏结蛋白聚糖4，促进平滑肌细胞增殖，导致血管重塑。此外，Ma等[14]认为，TNF-α通过诱导血管内皮因子的表达加重血管重塑。以上研究表明，内皮细胞损伤可引起炎症因子分泌增加，导致血管平滑肌细胞形态损伤、结构改变、功能障碍、增殖、迁移等病理改变，诱发血管重塑。因此，研究内皮细胞对平滑肌细胞的影响，对逆转血管重塑具有重要意义。内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型与体内细胞间结构最为相似，有利于维持细胞间形态和功能的稳定表达，是目前用于研究内皮细胞与平滑肌细胞之间相互作用的理想模型[10]。本实验以TNF-α构建高血压炎症环境，并在Transwell小室孔板底部培养内皮细胞，内侧培养平滑肌细胞，观察内皮细胞炎症对血管平滑肌增殖、迁移的影响。

本实验结果发现，TNF-α刺激的共培养体系中血管内皮细胞形态出现铺路石样的消失、细胞折光性降低，炎症因子IL-1β水平升高、IL-10降低，并引起共培养体系中平滑肌细胞形态损伤。给药干预后，复方七芍药物血清组、厄贝沙坦药物血清组、MRS2578组、MRS2578＋复方七芍药物血清组细胞形态呈不同程度恢复正常，折光率增高，炎症因子IL-1β水平下降，IL-10水平升高，以MRS2578＋复方七芍药物血清组效果最为显著。说明复方七芍降压片药物血清能改善炎症因子TNF-α诱导的内皮细胞及平滑肌细胞的形态损伤，抑制细胞上清液IL-1β、升高IL-10水平。

嘌呤受体P2Y6属G蛋白偶联受体家族成员，在内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等均有表达；内皮细胞P2Y6受体经脂多糖或TNF-α刺激，呈现高表达，诱导炎症因子IL-8和血管细胞黏附分子-1分泌，导致血管内皮细胞炎症的发生[15]。与Gq/11蛋白偶联后，可使MEK1/2蛋白活化，进而激活ERK1/2，调控炎症相关因子的表达[16]。ERK1/2作为细胞增殖和分化的主要途径[17]，磷酸化水平升高，可诱导多种炎症因子释放，血管平滑肌增殖、迁移，引发病理性血管重塑[18]。赵京山等[19]发现，羟基红花黄A通过下调血管平滑肌细胞（VSMC）中的MEK-ERK1/2的活性，抑制VSMC的增殖，防治病理性血管重塑；复方七芍降压片可通过下调肠系膜动脉中P2Y6受体表达，抑制下游信号通路（MEK1/2）/（ERK1/2）的活性，降低炎症水平，起到改善血管重塑的作用[20]。同时，Nishimura等[21]发现，P2Y6可促进血管紧张素Ⅱ诱导的血压升高，导致血管重构，而P2Y6拮抗剂通过抑制血管平滑肌细胞的增殖，能缓解血管紧张素Ⅱ诱导的血压升高，减弱血管重构。有研究表明，MRS2578是P2Y6受体拮抗剂，可通过阻断TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应，抑制血管平滑肌细胞的增殖，改善血管重塑；P2Y6受体激动剂UDP可刺激P2Y6受体上调，活化MEK-ERK1/2信号通路，调控IL-8等炎症因子的释放，导致小肠炎症的发生[22-24]。以上说明，内皮细胞中P2Y6受体高表达，可激活下游（MEK1/2）/（ERK1/2）信号通路，诱导炎症反应增强，损伤平滑肌细胞，导致血管重塑的发生。

本实验结果显示，与正常组比较，模型组和空白血清组内皮细胞P2Y6受体高表达，其下游信号通路MEK1/2、ERK1/2蛋白及mRNA表达均升高，调控的炎症因子IL-1β含量增加、IL-10含量减少。给药干预后，与模型组比较，复方七芍药物血清组、厄贝沙坦药物血清组、MRS2578组、MRS2578＋复方七芍药物血清组内皮细胞P2Y6受体表达降低，MEK1/2、ERK1/2蛋白表达及mRNA表达降低，细胞上清液IL-1β含量减少、IL-10含量增加，以MRS2578＋复方七芍药物血清组效果最显著。提示复方七芍降压片能降低内皮细胞P2Y6受体及其下游信号通路MEK1/2、ERK1/2蛋白表达，抑制炎症因子IL-1β水平，增加IL-10含量，改善血管平滑肌细胞形态损伤。

综上，复方七芍降压片改善血管重塑的机制可能为调控血管内皮细胞中P2Y6受体及其下游信号通路MEK1/2、ERK1/2的蛋白表达，改善炎症反应，保护平滑肌细胞形态、结构、功能，抑制其增殖、迁移，改善血管重塑。本实验设计以内皮细胞炎症引起平滑肌细胞形态损伤来研究高血压血管重塑，缺乏对内皮细胞功能、平滑肌细胞迁移及表型转化等诱发血管重塑重要因素的相关指标检测，有待今后进一步研究。

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Effects of CompoundTablets on Expression of P2Y6 Signal Pathway Related Factors of Vascular Endothelial Cells Co-cultured with Smooth Muscle Cells Induced by TNF-α

LIU Yeqian1, LI Hong1, GONG Shan1, CHEN Chunming1, MA Danfeng2, LIU Lin1,WANG Zhiqi3, ZENG Yong1, WANG Yuhong4, REN Weiqiong1

To observe the effects of compoundTablets on inflammatory factors and P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 protein expressions of vascular endothelial cells co-cultured with smooth muscle cells induced by TNF-α; To explore the mechanism of compoundTablets in the treatment of hypertension.Co-culture system was established by vascular endothelial cells and smooth muscle cells, and inflammatory factor TNF-α was used to establish a microenvironment for hypertension inflammation. The cultured cells were randomly divided into normal control group, model group, blank serum control group, MRS2578 group, irbesartan tablet drug-containing serum group, compoundTablets containing serum group, and MRS2578+compoundTablets containing serum group. MRS2578 group and MRS2578+compoundTablets containing serum group were added with 10 μmol/L MRS2578, and the normal group and model group were added with the same amount of culture medium; the remaining groups were added with 10% drug-containing serum and blank serum. The morphology of endothelial cells and smooth muscle cells were observed using an inverted microscope; IL-1β and IL-10 levels of inflammatory factors in cell supernatant were detected by ELISA; immunofluorescence, Western blot and RT-qPCR were used to detect the expressions of P2Y6, MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells.Compared with the normal control group, the number of vascular endothelial cells and smooth muscle cells in the model group and the blank serum control group was significantly reduced, the cell outline was not clear and the refractive index was reduced, and the number of floating dead cells increased; the level of IL-1β increased significantly and IL-10 decreased significantly (<0.01); P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the refraction of endothelial cells and smooth muscle cells increased, and the cell morphology returned to normal in compoundTablets containing serum group; the level of IL-1β decreased significantly; P2Y6, MEK1/2, ERK1/2 fluorescence intensity, gray value and mRNA levels decreased significantly (<0.01).CompoundTablets can obviously regulate TNF-α-induced endothelial inflammatory response, improve the injury of smooth muscle cells caused by endothelial inflammation, and maintain its normal function. The mechanism may be related to the regulation of protein expression of P2Y6 receptor and its downstream signaling pathways MEK1/2 and ERK1/2 in endothelial cells and improvement of the inflammatory response.

compoundTablets; endothelial cell; smooth muscle cell; P2Y6-MEK1/2-ERK1/2; inflammation; vascular remodelin; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0058-08

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004401

国家自然科学基金（81473616）；湖南省中医药管理局重点项目（201910）；湖南省科技厅项目（2018SK51203）；中医内科重大疾病防治及转化教育部重点实验室开放基金（ZYNK201703）；湖南中医药大学研究生校级创新课题（2019CX67）

任卫琼，E-mail：renweiqiong1@126.com

（2020-04-16）

（2020-04-28；编辑：华强）