基于色谱质谱法分析食品中硝基咪唑类药物残留的研究进展

朱姗姗,吴 澎,徐双双,纪文华,朱文卿,郑振佳,*(.山东农业大学食品科学与工程学院,山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室,山东泰安 708;.北京市理化分析测试中心,有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室,北京 00089;.山东省分析测试中心,齐鲁工业大学(山东省科学院),山东济南 5004)

硝基咪唑类药物是一类以硝基咪唑环为基础的化合物(图1),主要包括甲硝唑(Metronidazole,MNZ)、替硝唑(Tindazole,TNZ)、奥硝唑(Ornidazole,ONZ)、洛硝哒唑(Ronidazole,RNZ)、塞克硝唑(Secnidazole,SNZ)、地美硝唑(Dimetridazole,DMZ)等。由于硝基咪唑类药物抗菌能力较强且硝基类物质在生物还原方面有一定优势,所以硝基咪唑类物质可以有效检测细胞的缺氧部位;多种硝基咪唑类衍生物也可以与DNA、蛋白质等物质进行超分子结合[1-2],对癌症、感染、寄生虫等有一定的抑制作用,被广泛用于治疗畜禽的滴虫病、厌氧菌感染等疾病[3]。2019年发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]重新制定兽药最大残留限量,其中硝基咪唑类药物残留是重点检测对象。消费者食用含有残留过量的硝基咪唑类药物的肉类产品时会引起恶心、呕吐,甚至畸变、突变、癌变等症状,对人体造成危害[1,5],因此对硝基咪唑类药物进行准确检测的方法开发成为兽药检测重要方向。本文介绍了硝基咪唑类药物的分析检测现状以及硝基咪唑类物质在畜禽动物体内的代谢产物和部位,并且对国内外肉类食品中硝基咪唑类物质的前处理方法以及检测方法进行研究探讨,同时对硝基咪唑类物质及其代谢产物的残留检测分析方向进行展望。

图1 硝基咪唑类物质结构通式Fig.1 General structural formula of nitroimidazole

1 硝基咪唑类药物残留检测研究现状

目前对于硝基咪唑类药物的检测方法日益增加,以硝基咪唑为词条在中国知网进行检索共检出自1951年至2019年的文献1370个,其中自2015年至2019年的文献为288个,占到文献总数的21%,可看出近5年在硝基咪唑方面尤其是检测方法上的研究相对较多。在Web of Science以及中国知网数据库中的文献进行检索,对2011～2019年发表的文章中硝基咪唑检测方法进行整理(图2所示),发现前处理过程中固相萃取(Solid phase extraction,SPE)技术的使用可以占到71.58%,而液-液萃取技术(Liquid-liquid extraction,LLE)以及其他方法占比较少。在检索中发现常用的检测方法高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)和液相色谱-质谱联用技术((liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)的使用占到92%以上,而气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)近年来较少使用。

图2 中国知网数据库与Web of Science数据库文献统计情况Fig.2 Literature statistics at CNKI database and Web of Science database

2 硝基咪唑类药物代谢产物及其分布

常见的硝基咪唑类物质的基本信息见表1。硝基咪唑类物质进入动物机体经过肝脏代谢产生多种代谢产物,部分代谢产物会保留原来物质的特性,另一部分会代谢成高于或者低于原有物质所具特性的衍生物发挥作用[5]。目前国内外对于硝基咪唑类物质的代谢以及代谢物的检测的文章相对较少。为准确检测食品中的硝基咪唑类物质的残留量,需同时对硝基咪唑类药物的代谢物进行分析,硝基咪唑类药物的代谢过程相对复杂,大多经过肝脏代谢,代谢产物较多[1]。

表1 硝基咪唑类化合物的基本信息Table 1 Basic information of the nitrodetomidine compounds

2.1 甲硝唑

甲硝唑是一种可以抗厌氧菌以及原虫感染的硝基咪唑类衍生物,属于浓度依赖型抗菌药,临床上可用于治疗消化道、呼吸道、组织关节等处的厌氧菌感染。甲硝唑主要在肝脏内经过细胞色素P-450进行代谢,其侧链发生氧化代谢产生羟基化合物和羧基化合物等,动物体内代谢产物主要为1-(β-羟乙基)-2-羟甲基-5-硝基咪唑(HM),其次为2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙酸(MAA)、1-(β-羟乙基)-2-羧基-5-硝基咪唑(MOOH)等七种物质,其中羟基代谢物因具备抗菌活性而有临床意义[10-12]。羟基甲硝唑对相似菌株的活性为母体化合物的30%～65%,其活性要小于甲硝唑[13]。甲硝唑及其代谢物的代谢主要通过尿液排出,以药物原型形式排出的占6%～18%,HM占24%～28%,MAA占12%～20%,MOOH占8%～12%,14%的剂量经粪便排出体外,经由粪便排出时,被肠微生物活化为活性中间体,HM也会被微生物所活化,在有些情况下它比母体活性更高,极小部分通过乳汁以及胆汁排出[14-16]。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]规定允许甲硝唑的使用,但不得在动物性食品中检出。

2.2 替硝唑

替硝唑又称“服净”,作为硝基咪唑类衍生物的研发始于1969年,主要用于治疗滴虫病、贾第虫病的治疗[17]。作用机理为与厌氧菌细胞内的DNA、蛋白质等大分子物质相结合,导致厌氧菌失去正常的活性,进而达到抑制厌氧菌的作用[18]。替硝唑在药理上与甲硝唑相比,有更强的抗菌活性、耐受性、半衰期与疗效,同时副作用低于甲硝唑[17]。替硝唑代谢的主要场所也是肝脏,60%～80%经过肾脏排出,其中20%以原型的药物排出，其余代谢物以尿液排出,14%经皮肤排出,少部分经过粪便和乳汁排出[19-21]。

2.3 奥硝唑

奥硝唑的研究始发于1972年,是第三代硝基咪唑类衍生物,作用机理为通过还原与生物DNA结合使其无法转录进而导致细菌死亡,主要用于抗厌氧菌以及滴虫的感染。奥硝唑半衰期长于替硝唑与甲硝唑,耐受性与副作用优于两者[18]。奥硝唑是一种消旋体,在体内代谢过程中可以转化成左奥硝唑和右奥硝唑。左奥硝唑主要通过脂肪侧链氧化代谢以及侧链水解代谢,它在人体内的代谢产物有五种,分别是奥硝唑氧化得到的M1(1-氯-3-(2-羟甲基-5-硝基-1-咪唑基)-2-丙醇)和M2(2-甲基-5-硝基咪唑),水解得到的M3(N-(3-氯-2-羟丙基)乙酰胺)、M4(3-(2-甲基-5-硝基-1-咪唑基)-1,2-丙二醇)、M5(乙酰胺)[22]。左奥硝唑在中枢神经系统的毒性方面比奥硝唑以及右奥硝唑要低且安全效果更好[8]。奥硝唑大部分的代谢物主要经尿排出,其中游离代谢物与结合代谢物的比例为1∶2[1]。

2.4 洛硝哒唑

洛硝哒唑又称罗硝唑,学名为1-甲基-2-氨基甲酰氧甲基-5-硝基咪唑,主要用来治疗畜禽的组织滴虫病、细菌感染等疾病,在抗原生动物作用方面它的活性甚至是甲硝唑的5倍[23]。洛硝哒唑在生物体经过代谢后主要生成羟甲基甲硝咪唑,其代谢产物可能会与蛋白质等大分子物质进行结合,推断该路径是其抗菌活性的机理。洛硝哒唑的环状结构对人体有致癌性和致突变性的可能[24],由于部分被违法作为饲料添加剂用于提高饲料的转化率以及动物的重量,因此GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]中规定该组分在食品的兽残检测中不得检出。

2.5 地美硝唑

地美硝唑又称二甲硝唑,化学名为1,2-二甲基-5-硝基咪唑,主要用于治疗和预防禽畜的组织滴虫病以及厌氧菌感染等疾病,由于地美硝唑可以提高饲料的转化率并且可以促进动物的生长,所以在饲料中的添加相对较多[25-26]。地美硝唑的代谢物与洛硝哒唑相同,主要是羟甲基甲硝咪唑。由于地美硝唑具有遗传毒性,对人体有致癌、致畸等作用[26],1995年欧盟委员会第1798/95号法规规定禁止其在动物性食品中使用,GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》[4]中规定在养殖过程中允许地美硝唑进行治疗,但不得在动物性食品中检出。

2.6 塞克硝唑

塞克硝唑的化学名称为1-(2-羟丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑与甲硝唑和替硝唑在结构上相似,已被用于治疗阿米巴病、贾第虫病、毛滴虫病等疾病[27-28]。塞克硝唑的抗原生虫的生物活性与铁氧化还原蛋白还原酶调节的硝基的还原作用有关,通过被动扩散进入微生物体内,硝基还原后产生一个不稳定的中间体(带一个电子的硝基阴离子),氧化微生物的DNA,使DNA链断裂,破坏了DNA的螺旋结构,导致核酸合成受到抑制,引起细胞死亡[29]。相比较其他硝基咪唑类药物,塞克硝唑具有更长的半衰期,长时间残留对生物将会造成伤害[30]。塞克硝唑主要在肝脏代谢,对肝细胞色素P450酶无诱导或抑制作用,50%的药物以原型从肾排出,主要代谢物为RP35843[31]。

3 硝基咪唑类药物及其代谢产物的分析方法

3.1 样品前处理

硝基咪唑类物质容易与基质中的大分子物质结合,导致检测结果受到影响,因此将样品通过前处理有效提取硝基咪唑类物质是该类成分研究的热点。常用的前处理方式有液-液萃取法、固相萃取法、分子印迹技术和QuEChERS方法等。几种常用的样品前处理方法比较见表2。

表2 硝基咪唑类物质残留检测的样品前处理方法比较Table 2 Comparison of pretreatment methods of nitroimidazoles residues

3.1.1 液-液萃取法 液液萃取技术是利用样品中各个组分在液相间溶解度不同,使得被萃取的物质在两液相之间重新分配,达到分离的目的,该法可以在提取出目标物的同时减少溶剂对样品本身的影响,进而减少基质的影响[33]。目前液液萃取发展出盐析辅助液液萃取法、分散液液微萃取和旋涡辅助分散液液萃取等技术用于样品前处理。Hernández-Mesa等[38]利用盐析辅助液液萃取法作为前处理方法检测鱼卵样品中硝基咪唑的残留,结果显示MNZ-OH、HMMNI和MNZ的检测限分别为0.84、0.09和0.05 μg/kg,定量限分别为2.79、0.31和0.15 μg/kg,回收率为80.00%～93.9%。利用盐析辅助液液萃取技术作为前处理方法检测牛奶中硝基咪唑物质,结果显示取得的LOD符合欧盟参考实验室对MNZ和RNZ推荐的检测水平均为3 μg/L[39]。王春等[35]利用液液微萃取结合液质联用测定鱼血中硝基咪唑的残留,结果显示硝基咪唑类物质的检出限为0.05～0.2 μg/L,定量下限为0.1～0.5 μg/L,回收率为88.4%～105%。

3.1.2 固相萃取技术 固相萃取技术是分离和富集药物残留物的常用方法,工作原理是通过固体吸附剂保留目标分析物与其它基体以及干扰物分离,然后进行淋洗、洗脱步骤进而使目标化合物分离富集[40]。根据萃取柱中填料的不同,固相萃取技术可以分为反相固相萃取、正相固相萃取、离子交换型固相萃取等。近几年衍生出磁性固相萃取(MSPE)、分散固相萃取(dSPE)等新兴方法[41]。其中,磁相固相萃取技术是利用磁性吸附剂对目标物进行萃取的过程(如图3所示),分散固相萃取将分散剂分散到样品溶液中对目标物进行萃取的过程。Zhong等[42]利用在线固相萃取技术联合液相色谱检测猪肝脏中硝基咪唑含量,结果显示猪肝中加标样品的回收率为81.7%～97.8%,检测限符合中国对猪和家禽肌肉,肾脏和肝脏中DMZ和MNZ的最大残留限量(MRL)5和50 μg/kg的要求。Hernández-Mesa等[43]利用固相萃取技术结合毛细管电泳法测定牛奶中硝基咪唑物质,结果显示牛奶样品中的所有分析物的回收率均超过60%,同时5-NDZ及其代谢物的检测限低于CRL的建议值3 μg/L。Hu等[44]利用磁性固相萃取技术萃取地美硝唑,结果显示鸡蛋,奶粉和猪饲料样品的加标回收率为90.33%～106.20%,相对标准偏差小于4.54%。方力等[41]利用基质固相萃取技术结合液质联用对动物源性食品中硝基咪唑进行检测,得出MNZ-OH和HMMNI为0.2和0.5 μg/kg。固相萃取技术存在萃取时间较长,净化效果差对于分子结构相似度较高的物质不能将目标物较好的分离,目前分子印迹技术与固相萃取技术联用提高了萃取的效果,但对于分离、提取多种硝基咪唑类化合物方面研究较少,后期需加强可分离净化多种硝基咪唑类化合物的萃取剂的研究。

图3 磁性固相萃取技术示意图[45]Fig.3 Schematic diagram of magnetic solid phase extraction technology[45]

3.1.3 分子印迹技术 分子印迹技术(Molecular imprinting technology,MIT)的原理类似于抗原抗体、酶与底物的特异性结合,利用功能单体、交联剂以及致孔剂等进行混合将模板分子包裹起来形成具有完整性的聚合物,再通过适当的方法将模板分子去除,得到具有特异性识别能力的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers,MIPs),该过程如图4所示[46]。Guo等[47]利用分子印迹固相萃取技术测定蜂蜜中硝基咪唑类物质,该方法的检测限为1 μg/kg,低于标准要求的最大残留限量3 μg/kg。Hu等[44]利用有核-壳结构的新型二咪唑磁性分子印迹聚合物(DMMIP)检测鸡蛋和牛奶中甲硝唑的含量,结果表示DMZ的检出限为28.2 μg/L,回收率在90.33%～106.20%之间。该方法的线性范围比使用HPLC-UV和GC-ECNI-MS的线性范围大,回收率高[48-49]。目前对于分子印迹聚合物特异结合的机理研究较少,导致聚合多种硝基咪唑类物质的分子印迹聚合物的研发尚不完善,今后需研发效果更好的吸附和聚集多种硝基咪唑类物质的分子印迹聚合物。

图4 分子印迹技术的示意图[46]Fig.4 Schematic diagram of molecular imprinting technology[46]注:(a)在模板分子(T)和功能单体(M)之间形成络合物;(b)聚合;(c)模板提取;(d)分析物结合。

3.1.4 QuEChERS技术 QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)于21世纪初期开始发展[34]。此方法的主要过程为盐析萃取、分散固相萃取净化和色谱分析[34],操作流程见图5。高海荣[50]运用QuEChERS结合液质联用技术检测鱼肉中硝基咪唑类物质,有效的降低了基质效应,MNZ、DMZ和HMMNI的检出限分别为0.2、0.2和0.5 μg/kg,该方法具有准确、高效、灵敏度高的优点,适用于鱼肉中DMZ、HMMNI及MNZ的快速检测和日常筛查。Silva等[51]利用QuEChERS结合液质联用测定牛肌肉组织中硝基咪唑等物质的残留,使用该方法硝基咪唑类的定量限范围为0.007～0.706 μg/kg,定量限在0.011～1.203 μg/kg之间。Shendy等[52]利用QuEChERS结合液质联用测定蜂蜜中硝基咪唑的含量,结果显示检测限为0.12～0.74 μg/kg,回收率为90.96%～104.80%。目前QuEChERS技术自动化水平有限,但QuEChERS自动化可以确保大量样品的快速预富集,有助于节省成本,同时可以提高生产率和可重复性。因此,有必要对QuEChERS技术自动化进行探索。

图5 原始QuEChERS分析技术的主要步骤示意图[34]Fig.5 Schematic diagram of the main steps of the original QuEChERS analysis technique[34]

3.2 检测方法

目前对于硝基咪唑的检测方法主要是高效液相色谱、液质联用以及气质联用等。气质联用方法主要在2000～2010年期间使用作为检测硝基咪唑的方法之一,自2010年后气质联用技术就开始很少使用。部分硝基咪唑类物质及其代谢物的检测分析条件见表3。

表3 肉类食品中硝基咪唑类药物的检测分析条件Table 3 Analysis conditions of nitroimidazoles in meat food

表3总结了近年来在检测食品中硝基咪唑类物质的文献,可以看出检测硝基咪唑类物质的前处理方式中主要以固相萃取、QuEChERS以及液液萃取技术为主,其中固相萃取占比最多。固定相多采用C18色谱柱,其他色谱柱使用较少。流动相多采用水、乙腈和甲醇,其他溶剂使用较少。检测分析主要以液相串联质谱为主,其中三重四级杆质谱仪(QqQ)使用最多,而高分辨质谱仪使用较少。高分辨质谱仪可以对非目标物进行筛选且在多残留分析上具有显著优势,常用的高分辨质谱仪有飞行时间(TOF)质谱、四级杆飞行时间(Q-TOF)质谱、轨道阱质谱(Orbitrap)以及四级杆-轨道阱质谱(Q-Orbitrap)等。在多残留多类别分析上,高分辨质谱仪将发挥着不可替代的作用。前处理技术上各种微萃取形式不断出现,小型化水平进展较大,但自动化水平有待进一步提高,且有必要探索更加绿色化学的新型吸附材料。此外小型色谱柱如:微流液相色谱、毛细管液相色谱以及纳升液相色谱等的使用更适合痕量分析且有利于降低基质效应,但未见在硝基咪唑检测上的应用,有必要进一步探索。

4 展望

随着新兽药的研发、兽药检测难度的上升和人们对食品安全重视程度的增加,对检测技术的要求逐步提高。硝基咪唑兽药作为常用兽药,容易在使用过程中引起超标的问题,因此加强硝基咪唑代谢途径及代谢产物结构的相关研究,提高硝基咪唑类物质检测水平具有重要意义。目前硝基咪唑类物质的检测方法上以色谱-质谱法为主,其前处理方式的材料合成、方法优化以及自动化分析是近年来的研究热点。提高分子印迹技术、微固相萃取技术、磁性固相萃取技术以及结合新型吸附材料的萃取技术等对于多目标组分的定向净化与富集效果,是今后兽药残留中新材料合成与研发的重要研究方向。同时,开发新型定向筛选色谱柱与高分辨质谱分析仪的集成应用,加快分析速度,提高检测的灵敏度,建立兽药类组分的多级质谱数据库也是兽药检测的重要发展方向。