梓醇抑制AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞活化的作用研究

束安梅，高雨嫣，朱逸晖，王 威，许惠琴，杜 秋，陈 璟，吕高虹，卢金福

(南京中医药大学药学院, 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室, 江苏 南京 210023)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并发症之一，病理表现为肾小球肥大、基底膜增厚、细胞外基质积聚，是终末期肾病的主要致死原因[1]。新近研究显示[2]，晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)诱导的炎症反应在DN进程中扮演着重要角色。巨噬细胞是调节肾脏炎性反应的关键炎症细胞，其会随着不同微环境极化为M1或M2型，其中M1型巨噬细胞通过分泌大量的炎性因子IL-6、IL-12和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促进炎症反应[3]，M2型巨噬细胞分泌IL-10抑制炎症反应和促进组织修复[4]。肾小球内皮细胞作为主要的肾脏固有细胞，不仅是肾损伤的受害者，也是主动参与者[5]。AGEs刺激肾内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等[6]，激活、促进巨噬细胞向肾脏趋化，加重糖尿病肾脏炎性损伤。

梓醇(catalpol，Cat)是从中药地黄的块根中提取的一种环烯醚萜苷类化合物，具有降血糖、抗炎和抗氧化应激等作用[7]。研究显示[8]，Cat能够减少AGEs诱导的单核细胞炎症因子的分泌，抑制核转录因子NF-κB的转位，从而抑制AGEs介导的炎症。Cat可有效降低DN小鼠的血糖、升高血清胰岛素水平，改善肾脏的病理改变，减轻对肾脏固有细胞的损伤[9]。本实验旨在通过建立肾内皮细胞与巨噬细胞共培养模型，观察Cat对AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞活化的抑制作用，为探索糖尿病慢性炎症的防治提供实验依据。

1 材料

1.1 细胞株小鼠肾小球内皮细胞(mouse glomerular endothelial cells，MGECs)，购自北京北纳创联生物技术研究院，编号：BNCC340482；小鼠巨噬细胞(RAW264.7)，南京中医药大学药理实验室惠赠。

1.2 药物与试剂Cat标准品，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Z-005-190523；氨基胍(aminoguanidine，Ami)，美国Sigma公司，批号：079K1734V；高糖DMEM、Trypsin-EDTA、胎牛血清，美国Gibco公司，批号：AD17497268、42F1190K、25200-056；RIPA细胞裂解液、Triton X-100、DAPI染液，Solarbio公司；MCP-1、M-CSF、TNF-α、IL-12 ELISA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：201906；iNOS、CD206、ICAM-1、Arg-1抗体，Abcam公司；CD16/32抗体，Affinity公司；β-actin抗体，Bioworld公司；FITC-羊抗兔IgG，Boster公司；Anti-rabbit IgG，美国CST公司。

1.3 仪器二氧化碳细胞培养箱，日本SANYO公司；凝胶成像系统，美国GE公司；自动细胞计数仪，美国Countstar公司；垂直凝胶电泳仪，美国BIO-RAD公司；Ti型荧光显微镜，日本Nikon公司；高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司；3413、3422、3450 Transwell细胞培养皿，美国Corning公司。

2 方法

2.1 AGEs的制备将牛血清白蛋白(BSA，50 g·L-1)与葡萄糖(0.5 mol·L-1)充分溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)，37 ℃避光孵育4个月，使其形成AGEs-BSA溶液(即AGEs)。同时在平行条件下配制不含葡萄糖的BSA溶液，即无糖基化的0-BSA作为阴性对照。将孵育好的AGEs装在孔径为分子量1万的透析袋中，置于PBS缓冲液(0.01 mol·L-1)中4 ℃低温透析24 h以除去未反应的葡萄糖，使用0.22 μm微孔滤器过滤以除去溶液中的细菌。BCA蛋白定量法测定AGEs浓度为20.1 g·L-1。

2.2 细胞培养MGECs和RAW264.7用含胎牛血清(体积分数占0.10)及青链霉素混合液(体积分数占0.01)的高糖DMEM置于培养箱(37 ℃、5% CO2)中培养。

2.3 ELISA法检测细胞上清液中MCP-1、M-CSF、IL-12、TNF-α的分泌取对数生长期的MGECs用培养液调整至1×108个·L-1，每孔1 mL种于24孔板，另取RAW264.7调整至2×107个·L-1，每孔0.5 mL种于0.4 μm的Transwell小室内，于培养箱孵育至细胞贴壁融合后，更换不含胎牛血清的高糖DMEM饥饿培养12 h。将细胞分为空白组、模型组、Ami组(终浓度为10.0 μmol·L-1)、Cat组(终浓度为1.0、10.0 μmol·L-1)，每组设5个复孔。加入各药物预孵1 h后，用AGEs(终浓度为200 mg·L-1)刺激MGECs，并将Transwell小室移至接种MGECs的24孔板上方共培养48 h。吸取小室中RAW264.7上清液和24孔板内MGECs上清液，用ELISA试剂盒分别检测MCP-1、M-CSF和IL-12、TNF-α水平。

2.4 结晶紫染色法观察巨噬细胞的迁移调整MGECs至2×108个·L-1，每孔2 mL种于6孔板，调整RAW264.7至4×107个·L-1，每孔1 mL种于0.8 μm的Transwell小室内。分组和给药同上述“2.3”项，每组设3个复孔。取出小室并吸除培养液，用棉签轻轻擦去上层小室的RAW264.7，加入多聚甲醛室温固定30 min后用PBS洗3次，滴加结晶紫染色30 min，置于显微镜下观察单位视野下穿透膜的巨噬细胞数量。

2.5 免疫荧光法检测巨噬细胞标记蛋白iNOS和CD206的表达将细胞专用爬片置于Transwell小室中央，MGECs调整至2×108个·L-1，每孔2 mL种于6孔板，RAW264.7调整至4×107个· L-1，每孔0.5 mL种于0.4 μm的Transwell小室爬片。分组和给药同上述“2.3”项，每组设3个复孔。用事先预冷的PBS小心冲洗玻片3次，多聚甲醛室温固定15 min，PBS冲洗玻片3次。用Triton X-100室温通透20 min后，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加100 μL山羊血清室温封闭1 h，吸除封闭液，每片滴加100 μL一抗4 ℃过夜。次日每片滴加100 μL荧光二抗，37 ℃避光孵育2 h。PBS冲洗3次，加入DAPI避光染核5 min，PBS清洗4次后，吸去玻片上残余液体，置于荧光显微镜下观察。

2.6 Western blot法检测ICAM-1、iNOS、CD16/32、CD206、Arg-1蛋白表达调整MGECs至2×108个·L-1，每孔2 mL种于6孔板，调整RAW264.7至4×107个·L-1，每孔1 mL种于0.4 μm的Transwell小室内。分组和给药同上述“2.3”项，每组设3个复孔。吸去培养液，用事先预冷的PBS分别将RAW264.7和MGECs吹打混悬，置于EP管中离心后收集细胞，加入RIPA细胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白含量试剂盒测定浓度。蛋白样品按体积加入5×蛋白质上样缓冲液，95 ℃煮5 min后备用。SDS-PAGE凝胶电泳后转移到PVDF膜上，加入BSA(0.5 g·L-1)室温封闭2 h后，加一抗4 ℃孵育过夜。次日用PBST洗膜4次，每次15 min。加二抗室温孵育2 h后，再用PBST洗膜4次，每次15 min，ECL显色。以β-actin作为内参对照，利用ImageJ软件分析各组条带灰度值并进行计算定量。

3 结果

3.1 Cat对AGEs刺激肾内皮细胞表达MCP-1、M-CSF、ICAM-1的影响与空白组相比，模型组AGEs明显提高MGECs的MCP-1、M-CSF分泌水平(P<0.01)(Fig 1)和ICAM-1蛋白表达水平(P<0.01)(Fig 2)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其表达(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1浓度Cat抑制MCP-1、M-CSF分泌和降低ICAM-1蛋白表达的效果相对更好(P<0.01)。

3.2 Cat对AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞分泌IL-12、TNF-ɑ的影响与空白组相比，模型组AGEs明显升高MGECs介导RAW264.7分泌IL-12、TNF-α(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其分泌(P<0.05，P<0.01)，见Fig 3。

3.3 Cat对AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞迁移的影响与空白组相比，AGEs刺激肾内皮细胞介导共培养下的巨噬细胞明显向肾内皮细胞迁移(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其迁移(P<0.01)，见Fig 4。

Fig 1 Effect of catalpol on level of MCP-1, M-CSF in MGECs induced by AGEs n=5)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Mode

Fig 2 Effect of catalpol on expression of ICAM-1 in MGECs induced by AGEs n=3)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

Fig 3 Effect of catalpol on level of IL-12, TNF-α in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=5)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

Fig 4 Effect of catalpol on migration in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)##P<0.01 vs Control；**P<0.01 vs Model

3.4 Cat对AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞M1型极化标记蛋白iNOS、CD16/32的影响免疫荧光结果显示，与空白组相比，模型组AGEs明显增强MGECs介导RAW264.7 M1型标记蛋白iNOS的荧光强度(P<0.01)，加入Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)干预其荧光强度减弱(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1浓度Cat减弱iNOS荧光强度相对更好(P<0.01),见Fig 5。

Fig 5 Effect of catalpol on fluorescence expression of iNOS in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)##P<0.01 vs Control；*P<0.05,**P<0.01 vs Model

Western blot结果显示，与空白组相比，模型组AGEs明显上调MGECs介导RAW264.7 M1型标记蛋白iNOS、CD16/32的表达(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度下调其表达(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1浓度Cat下调iNOS、CD16/32蛋白表达的作用相对更好(P<0.01)，见Fig 6。

Fig 6 Effect of catalpol on expression of iNOS and CD16/32 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)1:Control; 2:Model; 3:Ami; 4:Catalpol 1.0 μmol·L-1; 5:Catalpol 10.0 μmol·L-1. ##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

3.5 Cat对AGEs刺激肾内皮细胞介导巨噬细胞M2型极化标记蛋白CD206、Arg-1的影响免疫荧光结果显示，与空白组相比，模型组AGEs减弱MGECs介导RAW264.7 M2型标记蛋白CD206的荧光强度(P<0.05)，加入Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)干预可明显增强其荧光强度(P<0.01),见Fig 7。

Western blot结果显示，与空白组相比，模型组AGEs下调MGECs介导RAW264.7 M2型标记蛋白CD206、Arg-1的表达(P<0.05)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可明显上调其表达(P<0.01)，见Fig 8。

Fig 8 Effect of catalpol on expression of CD206 and Arg-1 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)1:Control; 2:Model; 3:Ami; 4:Catalpol 1.0 μmol·L-1; 5: Catalpol 10.0 μmol·L-1. #P<0.05 vs Control; **P<0.01 vs Model

Fig 7 Effect of catalpol on fluorescence expression of CD206 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)#P<0.05 vs Control; **P<0.01 vs Model

4 讨论

随着人民生活水平的提高和饮食习惯的改变，近年来DN发病率迅速增加。在DN进程中，以巨噬细胞炎性浸润为代表的低水平炎症持续存在。对DN患者各时期的肾组织活检发现，在肾小球和肾小管间质均可见巨噬细胞炎性浸润，其浸润数量与肾小球硬化、肾纤维化程度呈正相关[10]。并且，肾组织中浸润的巨噬细胞存在明显的表型比例失衡，促炎的M1型巨噬细胞占大多数，通过改变巨噬细胞M1/M2的比例可明显减轻肾损伤[11]。

在生理状态下，巨噬细胞在器官组织中的数量极少，其迁移和功能调控均有精密机制[12]。但当糖尿病环境中的高糖、多元醇和AGEs等刺激肾脏时，血管内皮细胞受损，血管通透性增加，同时内皮细胞分泌大量的MCP-1、M-CSF和ICAM-1等，进而募集血液中的单核细胞黏附，浸润入肾脏组织活化为巨噬细胞。MCP-1是β趋化因子亚家族成员，可以促进巨噬细胞募集、迁移和极化。研究表明[13]，MCP-1的抑制作用与血流动力学无关，主要是通过抑制巨噬细胞的M1型极化和减弱肝素酶对糖原体的降解来降低大鼠蛋白尿。ICAM-1是免疫球蛋白超家族中的一种细胞表面糖蛋白，在DN早期即可检测到肾组织内ICAM-1的高表达，ICAM-1与巨噬细胞表面的配体LFA-1结合后，促进巨噬细胞黏附，介导巨噬细胞的迁移过程。对糖尿病ICAM-1基因敲除的小鼠研究发现，ICAM-1的缺失会使蛋白尿明显降低，伴随着肾脏中巨噬细胞的累积明显减少[14]。M-CSF是巨噬细胞存活、增殖和分化的一个主要调节因子，其调节巨噬细胞释放炎症因子如IL-12、IL-1β、TNF-α等，一方面直接导致肾脏损伤，如血管内皮细胞泡沫化、足细胞足突广泛融合、系膜细胞增生等[15]；另一方面，又继续增强巨噬细胞的募集、活化，扩大炎症反应，形成恶性循环。

巨噬细胞向肾组织的迁移、极化，以及炎症因子的释放均会造成肾脏的损伤。因此，阻断巨噬细胞的活化途径，可能是预防和治疗糖尿病肾病的有效策略。本实验建立了肾内皮细胞与巨噬细胞共培养模型，AGEs刺激肾内皮细胞后，趋化因子MCP-1和黏附分子ICAM-1表达增加，从而促进巨噬细胞向肾内皮细胞迁移，且巨噬细胞M1型标记蛋白iNOS、CD16/32表达升高、M2型标记蛋白CD206、Arg-1表达降低；同时肾内皮细胞M-CSF的高表达，使巨噬细胞分泌大量的炎性因子IL-12、TNF-α，而加入Cat预保护后再经AGEs刺激可明显减缓此效应。这表明Cat可通过减少肾内皮细胞分泌趋化因子MCP-1、M-CSF和黏附分子ICAM-1，抑制巨噬细胞迁移和炎性因子分泌，调节巨噬细胞M1/M2极化平衡，从而减轻炎症反应，延缓糖尿病肾病的发生和发展，但其具体作用机制有待进一步深入研究。