铁岭市城乡活禽市场外环境禽流感病毒检测结果分析

桂 佳 李婵媛 李 岩 王璐璐 姚文清*

（1.铁岭市疾病预防控制中心 辽宁铁岭 112000；2.辽宁省疾病预防控制中心）

1 前言

禽流感属于甲型流感病毒，是在多种家禽、野禽和鸟类之间传染的禽类传染病，禽流感病毒按照致病性强弱，可分为高致病性、低致病性和非致病性3 类，目前引起人类感染和发病的禽流感病毒主要为H5、H7 及H9 亚型，人感染禽流感主要是由于接触感染病毒的禽鸟及其分泌物和排泄物[1]。2013 年，我国首次发现并报告人感染H7N9 禽流感病毒，之后数年我国安徽、上海、浙江、福建等多省对此病毒均有报道[2]。 2016 年 6 月，辽宁省报告了 H7N9 首例病例，2017 年新增 5 例病例[3]。 有文献显示[4]，人类接触活禽或活动于活禽市场是感染禽流感病毒最主要的途径，因此加强活禽市场外环境检测显得尤为重要。为了解铁岭市城乡活禽市场外环境禽流感病毒的污染状况，发现禽流感的传染源，切断病毒传播途径，预防人感染禽流感病例的出现，本文对2016—2017 年铁岭市城乡活禽市场外环境禽流感样本检测结果进行分析。

2 材料和方法

2.1 样本来源

依据《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感检测方案（2011 年版）》和《辽宁省不明原因肺炎检测项目实施方案》 的要求，2016 年6—8 月、2017 年 3—5 月以及 2017 年 9 月，对铁岭市辖区内7 个县（市、区）城乡活禽市场进行采样，包括笼具表面擦拭样本、宰杀或摆放禽肉砧板表面擦拭样本、粪便样本、清洗禽类污水样本、禽类饮水样本和其他类型样本（包括禽、蛋表面擦拭等样本）。

2.2 仪器与试剂

仪器：核酸提取仪（江苏硕世生物科技有限公司）；Bio-Rad IQ5 荧光定量 PCR 仪（美国伯乐公司）。

试剂：病毒核酸提取试剂盒（磁珠法）、A 型流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）、禽流感病毒H5 亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）、禽流感病毒H7 亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）、禽流感病毒H9 亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）（江苏硕世生物科技有限公司，试剂均在有效期内使用）。

2.3 检测方法

2.3.1 病毒RNA 的提取

依据《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感检测方案（2011 年版）》对不同种类样本进行处理，取200 μL 处理后的样本上清液，加入核酸提取试剂盒（磁珠法），按照试剂盒说明书，利用全自动核酸提取仪完成样本病毒RNA 的提取。

2.3.2 实时荧光定量RT-PCR 扩增反应体系及条件

将提取好的RNA 进行A 型流感病毒核酸检测，对A 型流感病毒阳性样本进行H5、H7、H9 亚型禽流感病毒核酸检测。样本扩增的反应体系为：RTPCR 反应液 7.5 μL，酶混合液 5 μL，A 型流感病毒/禽流感病毒H5 亚型液反应液/禽流感病毒H7 亚型液反应液/禽流感病毒H9 亚型液反应液7.5 μL，待测样本RNA 5μL，总反应体积 25 μL。待测样本RNA 和阴性、阳性对照同时按照下列循环参数进行扩增检测：50℃下 30 min，95℃下 5 min；95℃下 10 s，55℃下40 s，45 个循环；55℃时荧光检测，检测通道为FAM。

2.4 结果判定

严格按照试剂盒说明书的判定标准进行试验结果的判定，阳性样本送至辽宁省疾病预防控制中心进行复核。

2.5 统计分析

采用Excel 2007 进行数据整理，采用SPSS 17.0软件统计分析，禽流感病毒核酸阳性率的组间比较采用 χ2检验和 Fisher's 精确检验，P＜0.05 表明差异有统计学意义。

3 结果

3.1 外环境禽流感病毒总体检测结果

2016—2017 年，共采集城乡活禽市场外环境检测样本254 份，检出A 型流感病毒阳性样本46 份，阳性率为18.11%，其中H5 亚型10 份，阳性率为3.94%；H9 亚型36 份，阳性率为14.17%；未检出H7 亚型、混合亚型和未分亚型样本。2016 年总阳性率为42.11%，2017 年总阳性率为13.89%，差异有统计学意义（χ2=17.348，P＜0.01）。2016 年 H5 亚型的阳性率为 23.68%，2017 年H5 亚型的阳性率为0.46%，差异有统计学意义（Fisher's 精确检验，P＜0.01）。2016 年 H9 亚型的阳性率为18.42%，2017 年H9 亚型的阳性率为13.43%，差异无统计学意义（χ2=0.663，P=0.416），结果详见表1。

表1 2016—2017 年铁岭市城乡活禽市场外环境禽流感病毒总体检测结果

3.2 不同时间外环境禽流感病毒检测结果

2016 年 6 —8 月、2017 年 3—5 月以及 2017 年9 月采集外环境检测样本，检测结果显示，每个月均有阳性样本检出，2016 年6—8 月阳性率较高，差异有统计学意义（χ2=28.769，P＜0.01）。 亚型分型结果显示，2016 年 6 月为 H9 亚型，而 2016 年 7—8 月均为H5 亚型，2017 年主要为H9 亚型，结果详见表2。

3.3 不同类型样本外环境禽流感病毒检测结果

在采集的254 份禽类市场外环境不同类型样本中，所有类型样本中均检出禽流感病毒H9 亚型，H5亚型主要在其他类型样本（禽表面擦拭样本）以及宰杀或摆放禽肉砧板表面擦拭样本和粪便样本中检出，各类型样本总阳性率差异无统计学意义（χ2=7.464，P=0.186），结果详见表3。

表2 不同时间外环境禽流感病毒检测结果

3.4 不同县（市、区）外环境禽流感病毒检测结果

铁岭市辖区内7 个县（市、区）除清河区和铁岭县外，其他5 个县（市、区）均检出禽流感病毒阳性样本，中心城区银州区活禽市场外环境禽流感病毒阳性率最高，为38.37%；其次为西丰县19.35%；调兵山市阳性率为10.53%；昌图县为10%；开原市为2.63%，差异有统计学意义（Fisher's 精确检验，P＜0.01），详见表4。

表3 不同类型样本外环境禽流感病毒检测结果

表4 不同县（市、区）外环境禽流感病毒检测结果

4 讨论

禽流感作为一种人禽（兽）共患病，不仅严重危害禽类养殖业，而且还会对公共卫生造成巨大威胁。禽流感病毒在禽类间存在稳定循环传播，而后发生抗原变异和病毒重组，使病毒跨越种属限制，出现哺乳动物感染，其中人的感染更受关注，特别是传染性强、病死率高的高致病性禽流感[5]。 城乡活禽市场禽类来源复杂，感染概率较大，是人感染禽流感的主要高危场所，研究表明多数患者发病前有活禽市场暴露史[6-8]。

2016—2017 年，铁岭市城乡活禽市场外环境检测样本禽流感病毒阳性率为18.11%，低于梧州市的34.54%[9]，珠海市的37.81%[10]，高于同期辽宁省城乡活禽市场样本禽流感病毒的平均阳性率8.08%[11]，禽流感病毒以H9 亚型为主，H5 亚型次之，这与全国其他地区流行趋势一致。2016 年总阳性率为42.11%，高于2017 年的13.89%，这与辽宁省总体检测结果不一致[11]，分析主要原因是铁岭市2016 年和2017 年采样时间和采样地点设置不同，2016 年采样时间为6—8 月， 采样地点主要集中在中心城区银州区，2017 年采样时间为3—5 月和9 月，采样地点覆盖铁岭市各县（市、区）。不同时间外环境禽流感病毒检测结果显示，每个月均有阳性样本检出，2016 年6—8 月阳性率较高，且 2016 年 6 月为 H9 亚型，而 2016 年7—8 月均为 H5 亚型，2017 年主要为 H9 亚型。有研究显示，禽流感病毒的检出一般呈现明显的季节性，冬春季节明显高于夏秋季节，第一季度高于其他季度，本次检测结果提示，夏季禽流感病毒也有较高的检出率，说明禽流感病毒在铁岭地区长期存在。不同类型样本中，所有类型样本均检出禽流感病毒H9 亚型，这表明禽流感病毒H9 亚型广泛分布于铁岭市活禽市场外环境之中。 H5 亚型主要在其他类型样本（禽表面擦拭样本）以及宰杀或摆放禽肉砧板表面擦拭样本和粪便样本中检出，提示禽类宰杀环节和销售过程中，从业人员存在感染风险，应加强个人防护。有研究显示粪便样本的禽流感病毒阳性检出率较低[12-14]，本次检测结果提示，禽类粪便样本中，禽流感病毒也有较高的检出率，不能忽视禽类粪便对外环境的污染。不同县（市、区）外环境禽流感病毒检测结果显示，中心城区银州区活禽市场外环境禽流感病毒阳性率最高，并且H5 亚型全部是在银州区活禽市场内检出，提示银州区活禽市场为高风险区域，需加强监管，应定期进行环境检测和消毒处理，严格执行活禽市场休市、消毒、检疫等制度，有效落实“一天一清洗，一周一消毒”的活禽市场管理措施，推行“规模养殖、集中屠宰、冷链运输、冰鲜上市”新模式，以降低人感染禽流感病毒风险。

本次检测基本掌握了铁岭市城乡活禽市场外环境中禽流感病毒流行特点和趋势，但检测时间短，检测样本量较小，存在不足之处，因此有必要进行长期检测，扩大检测样本量，扩大检测点范围等，以便更加科学全面地掌握本地禽流感病毒的流行特点。