五峰马里兰烟草花叶病及病毒检测

张曙光　孙红绪　王彦芬

摘要：为了摸清五峰马里兰烟草花叶病毒病的发生情况，采用田间调查和实验室RT-PCR技术进行了TMV、CMV和PVY的感染情况检测。结果表明，在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染，复合感染率为50%。其中，以TMV感染为主，检出率为100%；其次是CMV感染，检出率为50%；然后是PVY感染，检出率为40%。

关键词：五峰马里兰烟区；烟草花叶病；病毒检测； RT-PCR

中图分类号：S435.72 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3809-03

Abstract：In order to find out the occurrence of tobacco mosaic diseases in Maryland tabacco areas of Wufeng county，the infection of TMV，CMV and PVY was detected with RT-PCR technology and field investigation. The results showed that mixed infection with three viruses usually had complex symptom and the mixed infection rate was about 50%. The virus with the highest detection rate（100%）was TMV，followed by CMV and PVY with the detection rate of 50% and 40%，respectively.

Key words： Wufeng Maryland tobacco areas；tabacco mosaic disease；virus detection.

烟草花叶病毒病俗称烟草花叶病，是目前烟草产区分布最广、发生最为普遍的一类病害。1989～1991年进行的全国烟草侵染性病害调查表明，引起烟草病毒病的病毒共有17种[1]。据李锡宏等[2]调查，在湖北烟区发生的花叶病毒病主要是烟草普通花叶病（TMV）、黄瓜花叶病（CMV）和马铃薯Y病毒病（PVY），马里兰烟以CMV和PVY感染为主。近几年来，五峰马里兰烟草花叶病毒病连年发生，且呈逐年加重趋势，已成为危害烟草的一种主要病害，严重影响了五峰烟叶生产。为了进一步摸清五峰马里兰烟草花叶病毒病的发生情况，更有效地开展防治，进行了烟草花叶病毒病调查与病毒检测。

1 材料与方法

1.1 田间调查与取样

在湖北省五峰县王家坪村马里兰烟叶示范基地田间进行调查与取样，于5～8月采取系统调查与随机调查相结合，调查烟草花叶病毒病发病率，观察记载不同症状的发生情况。

在发病烟株上选取10份分别表现为脉明、斑驳、花叶、黄化、皱缩、卷曲等典型症状的新鲜烟草叶片，用保鲜膜包裹带回实验室检测。

1.2 引物

4种引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，详情见表1。

1.3 RNA提取

采样柱式分离方法提取RNA，步骤为：取待检材料嫩叶0.1 g，加液氮研磨成粉状，快速转入1.5 mL离心管中，加入800 μL SDS提取缓冲液，剧烈摇晃至混匀，65 ℃水浴5 min后离心，加入800 μL Binding Buffer混匀并加入400 μL无水乙醇，将混匀后的溶液加入吸附柱中。分别加入700 μL Wash Buffer和700 μL 80%乙醇洗涤（2次），风干后，溶于50 μL无菌水，-20 ℃保存。

1.4 RT-PCR扩增

以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一链，反应体系为20 μL，含5×反转录缓冲液4 μL、dNTPs （5 μmol/μL）1 μL、RNA酶抑制剂（RNasin，40 U/μL） 0.5 μL、M-MLV （200 U/μL） 0.5 μL、随机引物（100 pmol/μL）1 μL、RNA模板3 μL和DEPC处理水10 μL。PCR反应总体系为25 μL，含10×PCR溶液2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）[宝生物工程（大连）有限公司]0.2 μL、正向和反向引物各0.5 μL（10 μmol/L）、总核酸1 μL和灭菌的去离子水。扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳后在EB中染色10 min，将其置于凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.5 扩增产物克隆及测序

RT-PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切取含目标产物的凝胶，按琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒（V3.0，北京道普生物科技有限公司）说明回收目标DNA，与载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株感受态细胞，涂布在含50 mg/L氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基上，于37 ℃培养过夜。待菌落长出后随机挑取一定数量的白色单菌落，在含50 mg/L Amp的LB液体培养基中振荡培养，PCR鉴定为阳性克隆后，将菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 田间烟草花叶病毒病调查结果

根据2012-2013年在五峰马里兰烟区的田间系统调查，烟草花叶病毒病一般始发于5月中下旬至6月上旬，7月上中旬达到发病高峰期。一般发病率为30%～40%，重病田发病率可达70%～80%。症状表现为脉明、退绿、斑驳、花叶、黄化、皱缩、卷曲等多样化典型病毒症状，说明田间症状具有复杂性，并存在大量复合感染。在感染病毒的植株中下部成熟烟草叶片上症状不明显，出现隐症现象，仅在顶端嫩叶上呈现典型病毒病症状。

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测（表2）。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序，序列分析结果显示，各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上，确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到5份为阳性（图1），检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到10份为阳性（图2），检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到4份为阳性（图3），检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果，在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染，复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%，复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看，主要以TMV侵染为主，检出率为100%；其次是CMV侵染，检出率为50%；然后是PVY侵染，检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强，能在土壤和粪肥中长时间存活，存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源，田间主要通过接触摩擦传染，整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染，使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田间通过蚜虫传播，引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609（Md609）选育而来，对TMV、CMV和PVY不具抗性，表现感病[8]。因此，培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12，可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖，具有一定的防治效果[9]。

参考文献：

[1] 李怀方，刘凤权，郭小密，等.园艺植物病理学[M].北京：中国农业大学出版社，2001.

[2] 李锡宏，黎妍妍，许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保，2010（5）：15-16.

[3] 徐平东，周仲驹，林奇英，等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报，1999（2）：164-170.

[4] 刘文洪，洪 健，陈集双，等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报，2004（4）：442-445.

[5] 黄金光，邓丛良，李怀方，等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报，2004，34（3）：215-220.

[6] 吴兴泉，陈士华，陈 涛，等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学，2007（10）：64-66.

[7] 张友臣，李锡宏，雎 韡，等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学，2013，52（2）：327-330.

[8] 钱祖坤，文光红，赵传良，等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建国，肖启明，刘双清，等，烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学，2013，41（1）：121-122.

（责任编辑 陈 焰）

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测（表2）。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序，序列分析结果显示，各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上，确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到5份为阳性（图1），检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到10份为阳性（图2），检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到4份为阳性（图3），检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果，在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染，复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%，复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看，主要以TMV侵染为主，检出率为100%；其次是CMV侵染，检出率为50%；然后是PVY侵染，检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强，能在土壤和粪肥中长时间存活，存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源，田间主要通过接触摩擦传染，整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染，使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田间通过蚜虫传播，引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609（Md609）选育而来，对TMV、CMV和PVY不具抗性，表现感病[8]。因此，培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12，可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖，具有一定的防治效果[9]。

参考文献：

[1] 李怀方，刘凤权，郭小密，等.园艺植物病理学[M].北京：中国农业大学出版社，2001.

[2] 李锡宏，黎妍妍，许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保，2010（5）：15-16.

[3] 徐平东，周仲驹，林奇英，等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报，1999（2）：164-170.

[4] 刘文洪，洪 健，陈集双，等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报，2004（4）：442-445.

[5] 黄金光，邓丛良，李怀方，等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报，2004，34（3）：215-220.

[6] 吴兴泉，陈士华，陈 涛，等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学，2007（10）：64-66.

[7] 张友臣，李锡宏，雎 韡，等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学，2013，52（2）：327-330.

[8] 钱祖坤，文光红，赵传良，等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建国，肖启明，刘双清，等，烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学，2013，41（1）：121-122.

（责任编辑 陈 焰）

2.2 烟草花叶病毒病类型检测

利用RT-PCR技术对10份新鲜烟叶病害标本进行TMV、CMV和PVY的感染情况检测（表2）。各选取一个病毒分离物的扩增产物进行克隆和测序，序列分析结果显示，各病毒扩增片段与GenBank登录的相应病毒的核苷酸序列相似性达97%以上，确认检测结果正确。

2.2.1 黄瓜花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物CMV-3F/3R、CMV1/2对CMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到5份为阳性（图1），检出率为50%。

2.2.2 烟草花叶病毒RT-PCR检测结果 采用引物TMV mpf/3nr对TMV进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到10份为阳性（图2），检出率为100%。

2.2.3 马铃薯Y病毒RT-PCR检测结果 采用引物PVY P5/P3对PVY进行RT-PCR扩增检测，从10份烟草样品中检测到4份为阳性（图3），检出率为40%。

3 讨论

根据检测结果，在五峰马里兰烟区发生的烟草花叶病常表现为TMV、CMV与PVY的复合感染，复合感染率为50%。既有TMV+CMV感染，也有TMV+PVY感染，还可以是TMV+CMV+PVY复合感染。与张友臣等[7]对十堰市烟草病毒病的调查“单独侵染占41.89%，复合侵染占58.11%”的结论基本一致。从五峰马里兰烟区引起花叶病的病毒来看，主要以TMV侵染为主，检出率为100%；其次是CMV侵染，检出率为50%；然后是PVY侵染，检出率为40%。与李锡宏等[2]认为湖北马里兰烟区烟草花叶病以CMV、PVY感染为主的结论不同。

由于TMV抗逆性强，能在土壤和粪肥中长时间存活，存在于土壤或肥料中的带毒烟叶残体往往是其主要初侵染源，田间主要通过接触摩擦传染，整枝打顶、中耕除草等农事操作造成的微伤也能引起反复再侵染，使病害扩大蔓延。而CMV、PVY的初侵染源主要是来自感病的黄瓜、番茄、白菜等栽培或野生寄主植物，在田间通过蚜虫传播，引起病害蔓延。目前在五峰烟区推广栽培的五峰1号是由马里兰烟609（Md609）选育而来，对TMV、CMV和PVY不具抗性，表现感病[8]。因此，培育无毒烟苗和有效防治蚜虫成为病毒病主要防治措施。使用抗病毒病制剂GHA-Virizol、抗性激活剂R12，可以钝化病毒活性、抑制病毒在植物体内增殖，具有一定的防治效果[9]。

参考文献：

[1] 李怀方，刘凤权，郭小密，等.园艺植物病理学[M].北京：中国农业大学出版社，2001.

[2] 李锡宏，黎妍妍，许汝冰.湖北省烟草主要病害发生规律及原因浅析[J].湖北植保，2010（5）：15-16.

[3] 徐平东，周仲驹，林奇英，等.黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较[J].病毒学报，1999（2）：164-170.

[4] 刘文洪，洪 健，陈集双，等.侵染东方百合的黄瓜花叶病毒两个分离物CP基因克隆和进化分析[J].农业生物技术学报，2004（4）：442-445.

[5] 黄金光，邓丛良，李怀方，等.烟草花叶病毒丁香分离物的分离与鉴定[J].植物病理学报，2004，34（3）：215-220.

[6] 吴兴泉，陈士华，陈 涛，等.河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定[J].河南农业科学，2007（10）：64-66.

[7] 张友臣，李锡宏，雎 韡，等.十堰市烟草病毒病的调查及防治策略[J].湖北农业科学，2013，52（2）：327-330.

[8] 钱祖坤，文光红，赵传良，等.马里兰烟新品种五峰1号的选育及特征特性[J].安徽农业科学，2012，40（24）：11972-11973.

[9] 周建国，肖启明，刘双清，等，烟草花叶病毒病发生及防治研究进展[J].安徽农业科学，2013，41（1）：121-122.

（责任编辑 陈 焰）