Genetop马铃薯病毒试剂盒在马铃薯病毒检测上的应用综述

颉瑞霞　张小川　王效瑜　郭志乾　吴林科　余帮强　张国辉

摘要 生物芯片检测技术是一种检测速度快、灵敏度高、专一性强的新型病毒检测技术。genetop马铃薯病毒试剂盒具有可同时检测出7种病毒（PVY可分型PVY与PVYN）与1种类病毒，直接检测薯块，所用试剂无毒，操作简便且病毒与类病毒全部检测平均成本低于ELISA等特点。对genetop马铃薯病毒试剂盒检测方法的原理、特点及马铃薯种薯生产与质量控制体系中的应用前景进行了综述。

关键词 生物芯片检测；马铃薯；病毒检测

中图分类号 S412 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）21-0104-01

生物芯片（Biochip）是20世纪90年代中期以来形成的最具深远意义的重大科技进展之一[1]，目前主要应用在医学和食品等领域[2]。近年来，生物芯片检测技术是继酶联免疫吸附、免疫胶体金技术（ICG）和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法应用之后，又一种利用核酸专一性，检测速度快、灵敏度高、专一性强、操作简便、结果易读取的新型病毒检测技术[3-7]。笔者就Genetop马铃薯病毒试剂盒检测方法的原理、特点及在马铃薯种薯生产中的应用前景进行综述。

1 genetop马铃薯病毒试剂盒检测的基本原理

genetop马铃薯病毒试剂盒是由台湾巨合生物科技股份有限公司开发的新型马铃薯病毒生物芯片试剂，该试剂盒针对马铃薯病毒病中的核酸进行分子检测，在生物芯片孔盘表面已预先植入8种马铃薯病毒之专一性探针，病毒核酸萃取后经由一步核酸反转录聚合酶连锁反应，将马铃薯病毒特有的基因片段讯号放大，与芯片盘上的探针进行专一性结合；反应结果可利用肉眼直接判读。genetop马铃薯病毒试剂盒主要包括核酸萃取（Virus RNA Extraction）、一步骤核酸反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR）以及核酸杂合反应（Hybridization），同时使用生物素与碱性磷酸酶系统的化学非放射性的呈色方法进行显色，避光染色后，结果可利用肉眼直接读取。该方法是进行定性检测的一种有效方法。

2 马铃薯病毒病生物芯片检测技术步骤

2.1 样品的制备

取待检测脱毒苗茎段、薯块（取上部试管苗0.3 g或切取靠近块茎脐部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）样品分别标记后，加入细胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速离心30 min吸取上清液100 ？滋L，初样品在PCR仪器中加热99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min离心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即为检测样品，备用。

2.2 一步骤核酸反转录与生物芯片杂合反应

向0.5 mL eppendorf管中加入检测样品2 ？滋L、RT-PCR混合试剂（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR扩增（扩增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、进入循环后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s进行30次循环，72 ℃ 7 min、温度8 ℃），PCR扩增结束后95 ℃ 3.5 min断链，进入杂合反应阶段：吸取扩增样品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min条件下进行杂合反应，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗两边，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻断液=0.1∶100.0）55 ℃静置20 min阻断杂合反应，继续加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗两边，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色剂∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液显色，避光7 min。自来水冲洗，直接观察结果。

2.3 结果读取

生物芯片检测的结果分为失效、阳性、阴性。失效：质控位点（C3或A1、A5、E1、E5）不显色，说明PCR反应和杂合反应已失效；阴性：质控位点（C3和A1、A5、E1、E5）均出现颜色较深的黑点，检测位点（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不显色，说明马铃薯样品无被检测病毒；阳性：质控位点（C3和A1、A5、E1、E5）均出现颜色较深的黑点，检测位点（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出现颜色明显的黑点，说明马铃薯样品带病毒。检测稳点颜色越深，样品中的被检测病毒含量越高。

3 genetop马铃薯病毒试剂盒的优点

genetop马铃薯病毒试剂盒利用核酸的专一性，可直接

（下转第106页）

生物芯片（Biochip）是20世紀90年代中期以来形成的最具深远意义的重大科技进展之一[1]，目前主要应用在医学和食品等领域[2]。近年来，生物芯片检测技术是继酶联免疫吸附、免疫胶体金技术（ICG）和反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法应用之后，又一种利用核酸专一性，检测速度快、灵敏度高、专一性强、操作简便、结果易读取的新型病毒检测技术[3-7]。笔者就Genetop马铃薯病毒试剂盒检测方法的原理、特点及在马铃薯种薯生产中的应用前景进行综述。

1 genetop马铃薯病毒试剂盒检测的基本原理

genetop马铃薯病毒试剂盒是由台湾巨合生物科技股份有限公司开发的新型马铃薯病毒生物芯片试剂，该试剂盒针对马铃薯病毒病中的核酸进行分子检测，在生物芯片孔盘表面已预先植入8种马铃薯病毒之专一性探针，病毒核酸萃取后经由一步核酸反转录聚合酶连锁反应，将马铃薯病毒特有的基因片段讯号放大，与芯片盘上的探针进行专一性结合；反应结果可利用肉眼直接判读。genetop马铃薯病毒试剂盒主要包括核酸萃取（Virus RNA Extraction）、一步骤核酸反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR）以及核酸杂合反应（Hybridization），同时使用生物素与碱性磷酸酶系统的化学非放射性的呈色方法进行显色，避光染色后，结果可利用肉眼直接读取。该方法是进行定性检测的一种有效方法。

2 马铃薯病毒病生物芯片检测技术步骤

2.1 样品的制备

取待检测脱毒苗茎段、薯块（取上部试管苗0.3 g或切取靠近块茎脐部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）样品分别标记后，加入细胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速离心30 min吸取上清液100 ？滋L，初样品在PCR仪器中加热99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min离心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即为检测样品，备用。

2.2 一步骤核酸反转录与生物芯片杂合反应

向0.5 mL eppendorf管中加入检测样品2 ？滋L、RT-PCR混合试剂（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR擴增（扩增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、进入循环后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s进行30次循环，72 ℃ 7 min、温度8 ℃），PCR扩增结束后95 ℃ 3.5 min断链，进入杂合反应阶段：吸取扩增样品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min条件下进行杂合反应，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗两边，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻断液=0.1∶100.0）55 ℃静置20 min阻断杂合反应，继续加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗两边，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色剂∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液显色，避光7 min。自来水冲洗，直接观察结果。

2.3 结果读取

生物芯片检测的结果分为失效、阳性、阴性。失效：质控位点（C3或A1、A5、E1、E5）不显色，说明PCR反应和杂合反应已失效；阴性：质控位点（C3和A1、A5、E1、E5）均出现颜色较深的黑点，检测位点（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不显色，说明马铃薯样品无被检测病毒；阳性：质控位点（C3和A1、A5、E1、E5）均出现颜色较深的黑点，检测位点（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出现颜色明显的黑点，说明马铃薯样品带病毒。检测稳点颜色越深，样品中的被检测病毒含量越高。

3 genetop马铃薯病毒试剂盒的优点

genetop马铃薯病毒试剂盒利用核酸的专一性，可直接检测叶片、组培苗和种薯块茎中是否携带病毒，有效解决了ELISA只检测叶片或薯块，不能检测类病毒的问题，以生物芯片检测为技术核心的genetop马铃薯病毒试剂盒比传统RT-PCR检测具有以几个方面的优点：时间短、准确度和灵敏度高，扩充性与多重检测效果好，所用试剂无毒害、检测结果肉眼可判读，操作简便，易于推广。genetop马铃薯病毒试剂盒量化检测时，平均价格低于ELISA，该试剂盒的推广有助于马铃薯种薯病毒检测的效率和质量提升，操作步骤简单，易在基层种薯监控单位和种薯繁育企业推广。

4 genetop马铃薯病毒试剂盒在马铃薯种薯质量控制体系中的应用前景

我国马铃薯种植面积54.32万hm2，面积位居世界首位，产量水平较低（15 818 kg/hm2），是发达国家产量水平的1/3～1/2，我国马铃薯产量远低于世界平均水平（2012年FAO数据）。影响我国马铃薯产量的主要因素是病毒病危害，研究证明马铃薯病毒引起马铃薯减产10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的产量损失[8]。利用茎尖分生组织培养技术获得脱毒复壮种薯，可从根本上解决这一问题，种薯的质量是影响马铃薯产量的重要因素。目前，我国大面积推广应用的DAS-ELISA检测技术只能检测试管苗或植株，不能对原原种、原种和一级种薯块茎进行直接快速检测[3]。特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低的病毒检测技术的缺乏是是限制马铃薯种薯市场瓶颈。以生物芯片检测为技术核心的genetop马铃薯病毒试剂盒有效解决了ELISA漏检的问题，达到了检测叶片、组培苗或薯块，一个反应具有可同时检测多种病毒、检测时间短、操作简便、易于推广等特点。目前，马铃薯病毒生物芯片检测技术在马铃薯种薯质量控制体系中的应用刚刚起步，该产品在欧洲市场已进入试用阶段。该技术现已得到国内外学者的高度重视，因此马铃薯病毒生物芯片检测技术在马铃薯种薯生产和质量控制体系中具有巨大的发展潜力和应用前景。

5 参考文献

[1] 谷宇.马铃薯病毒与类病毒检测芯片的制备及应用[D].南京：东南大学，2004.

[2] 吴明煜，郭晓红，王万贤，等.生物芯片研究现状及应用前景[J].科学技术与工程，2005（7）：421-430.

[3] 杨小琴，张艳艳，张媛媛，等.马铃薯病毒检测技术研究进展[J].现代农业科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

[5] HADIDI A，CZOSNEK H，BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses，viroids，and phytopl-asmas[J].Plant Pathol，2004，86：97-104.

[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中國马铃薯主要病害图鉴[M].北京：中国农业出版社，2004.（上接第104页）

检测叶片、组培苗和种薯块茎中是否携带病毒，有效解决了ELISA只检测叶片或薯块，不能检测类病毒的问题，以生物芯片检测为技术核心的genetop马铃薯病毒试剂盒比传统RT-PCR检测具有以几个方面的优点：时间短、准确度和灵敏度高，扩充性与多重检测效果好，所用试剂无毒害、检测结果肉眼可判读，操作简便，易于推广。genetop马铃薯病毒试剂盒量化检测时，平均价格低于ELISA，该试剂盒的推广有助于马铃薯种薯病毒检测的效率和质量提升，操作步骤简单，易在基层种薯监控单位和种薯繁育企业推广。

4 genetop马铃薯病毒试剂盒在马铃薯种薯质量控制体系中的应用前景

我国马铃薯种植面积54.32万hm2，面积位居世界首位，产量水平较低（15 818 kg/hm2），是发达国家产量水平的1/3～1/2，我国马铃薯产量远低于世界平均水平（2012年FAO数据）。影响我国马铃薯产量的主要因素是病毒病危害，研究证明马铃薯病毒引起马铃薯减产10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的产量损失[8]。利用茎尖分生组织培养技术获得脱毒复壮种薯，可从根本上解决这一问题，种薯的质量是影响马铃薯产量的重要因素。目前，我国大面积推广应用的DAS-ELISA检测技术只能检测试管苗或植株，不能对原原种、原种和一级种薯块茎进行直接快速检测[3]。特异性强、灵敏度高、操作简便、成本低的病毒检测技术的缺乏是是限制马铃薯种薯市场瓶颈。以生物芯片检测为技术核心的genetop马铃薯病毒试剂盒有效解决了ELISA漏检的问题，达到了检测叶片、组培苗或薯块，一个反应具有可同时检测多种病毒、检测时间短、操作简便、易于推广等特点。目前，马铃薯病毒生物芯片检测技术在马铃薯种薯质量控制体系中的应用刚刚起步，该产品在欧洲市场已进入试用阶段。该技术现已得到国内外学者的高度重视，因此马铃薯病毒生物芯片检测技术在马铃薯种薯生产和质量控制体系中具有巨大的发展潜力和应用前景。

5 参考文献

[1] 谷宇.马铃薯病毒与类病毒检测芯片的制备及应用[D].南京：东南大学，2004.

[2] 吴明煜，郭晓红，王万贤，等.生物芯片研究现状及应用前景[J].科学技术与工程，2005（7）：421-430.

[3] 杨小琴，张艳艳，张媛媛，等.马铃薯病毒检测技术研究进展[J].现代农业科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

[5] HADIDI A，CZOSNEK H，BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses，viroids，and phytopl-asmas[J].Plant Pathol，2004，86：97-104.

[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中国马铃薯主要病害图鉴[M].北京：中国农业出版社，2004.