草莓根尖脱毒组培及无病毒苗繁育技术研究

钱长根+汪霞+朱造杰+周素梅+秦伟+严成其

摘 要：针对传统的草莓茎尖脱毒组培技术所存在的操作繁琐、效率低、消毒难彻底、组培苗污染率高等问题，课题组根据多年试验研究成果，提出了一种操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快，苗质好的草莓根尖脱病毒组培及其病毒快速检测技术，摸索出一套草莓根尖脱病毒组培快繁及规模化生产技术。

关键词：草莓；根尖脱毒；组培快繁；病毒检测；无病毒苗繁育

中图分类号 S668.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）17-0052-02

我国是世界上草莓野生资源最为丰富的国家，很早就开始利用野生草莓，并一直沿用至今。20世纪80年代以来，我国草莓生产发展迅速，目前其生产面积已位居世界第一。其中主要生产地分布在安徽、辽宁、河北、山东、江苏、上海、浙江、四川、新疆、北京等地区。但由于草莓是草本植物，长期靠匍匐茎繁殖，易受病毒病的严重危害。

1 病毒对草莓的危害

为害草莓的病毒和类病毒种类繁多，约有28种，主要有轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus，“SMYEV”）、镶脉病毒（strawberry vein banding virus，“SVBV”）、皱缩病毒（Strawberry crinkle virus，“SCV ”或“SCrV”）、斑驳病毒（strawberry mottle virus，“SMoV”）等。许多病毒侵染草莓后早期症状不明显，给病害防治带来了很大困难。如：草莓轻型黄边病毒单独侵染栽培种草莓苗后，使草莓早期生长势变弱、植株轻微矮化，后期产量和果实品质严重下降，减产率高达25%。草莓斑驳病毒单独侵染栽培种草莓苗时，早期症状也不明显，只有当它与其他病毒复合侵染草莓苗时才表现出斑驳症状；但草莓植株受此病毒侵染后，病株长势会逐渐衰退，产量和品质明显下降，减产率达20%～30%。草莓镶脉病毒单独侵染栽培种草莓苗时，无明显症状，但会使草莓植株生长势衰弱，匍匐茎抽生量减少、繁殖力减弱，产量和品质下降；当它与斑驳病毒、轻型黄边病毒复合侵染后，会引起病株叶片皱缩、扭曲，植株极度矮化。与前述3种病毒不同的是草莓皱缩病毒，它是对草莓危害性最大的病毒病。受它侵染的草莓病株前期发病症状较为明显，叶片变小、畸形，并产生褪绿病斑，沿叶脉出现小而不规则的褪绿斑、坏死斑，叶脉褪绿、透明，幼叶生长不对称、扭曲皱缩，小叶黄化，叶柄变短；植株矮化，匍匐茎抽生量减少，繁殖力下降，果实变小，单独侵染时减产率高达35%～40%；与其他病毒复合侵染时，减产率会更高，甚至绝产。防治草莓病毒最好的方法是选用新品种或通过草莓根茎尖脱病毒与组培快繁技术生产无病毒种苗。

2 草莓根尖脱毒与组培快繁技术

针对传统的草莓茎尖脱毒组培技术所存在的操作繁琐、效率低、消毒难彻底、组培苗污染率高等问题，项目组研究出了一种操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快，苗质好并与病毒检测技術相配套的草莓根尖脱病毒与组培快繁技术。

2.1 材料预处理及外植体选取与消毒 （1）材料预处理。采用先热处理母株，然后切取根茎顶芽进行顶端分生组织培养的方法，可除去部分单用根茎尖培养难以汰除的病毒。处理方法是，将草莓苗放入经消毒灭菌的细沙内，在37℃±2℃条件下进行热处理6～12周，直至抽生出根系。（2）根尖外植体的选取与消毒。切取长约1～2cm的主根根尖，经70%～75%酒精消毒30s，0.1%升汞加一滴土温摇动消毒8min，以及无菌水冲洗3～5次后，在实体显微镜下将前端长约0.1～0.2mm的根尖切下作为外植体，备用。

2.2 幼芽诱导培养 （1）诱导培养技术。将经消毒灭菌的根尖外植体接种于根尖诱导培养基上，放入培养室培养。首先，在室温25℃±2℃，光照强度1000±200lx，光照时间16h±2h∕d的条件下培养4周；然后，将光照强度提高至2000±500lx培养6周，最后，将光照强度增强至4000±500lx，持续培养直至从根尖诱导出草莓再生植株的幼芽。（2）培养基配制。经试验研究，草莓根尖诱导培养适宜的培养基配方为，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+6-BA0.3～0.5mg/L+2.4-D 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、琼脂7～9g/L。培养基适宜pH值5.6～5.8。

2.3 脱毒苗增殖培养 （1）增殖培养技术。将从根尖诱导出的草莓再生植株幼芽接种于增殖培养基上，放入培养室培养。培养室温度控制在25℃±2℃，光照强度控制在2000～3000lx，光照时间为16h±2h∕d，持续培养3～4周，直至长成带3～5个分蘖的小苗。以后每隔3～4周进行1次增殖扩繁培养，直至草莓脱病毒苗数满足繁育需要。（2）培养基配制。经试验研究，草莓脱病毒增殖培养适宜的培养基配方为，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+ NAA 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、琼脂7～9g/L。培养基适宜pH值5.6～5.8。

2.4 脱毒苗继代培养 （1）继代培养技术。将草莓脱病毒小苗剪成1～3cm长的小段，接种在继代培养基上，放入培养室培养。培养室温度控制在25℃±3℃，光照强度控制在2500±500lx，光照时间为16h±2h∕d。持续培养直至长成8～10cm长的草莓无病毒小苗。（2）培养基配制。经试验研究，草莓脱病毒苗继代培养适宜的培养基配方为，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO450mg/L+6-BA 0.1～0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、琼脂7～9g/L。培养基适宜pH值5.6～5.8。endprint

2.5 幼苗生根培养 （1）生根培养技术。将继代扩增培养成的草莓无病毒小苗接种于生根培养基上，放入培养室培养。培养室温度控制在25℃±3℃，光照强度控制在2000～3000lx，光照时间在16h±2h/d。持续培养1～2周后逐渐长出根系，继而长成完整的草莓脱病毒组培苗。（2）培养基配制。经试验研究，草莓脱病毒幼苗生根培养适宜的培养基配方为，MS+NH4NO3 400mg/L+KNO3 500mg/L+KH2PO4 50mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L，加蔗糖20g/L、琼脂7～9g/L。培养基适宜pH值5.6～5.8。

3 草莓无病毒苗繁育技术

3.1 组培苗病毒检测 目前，危害草莓最为严重的轻型黄边病毒（“SMYEV”）、镶脉病毒（“SVBV”）、皱缩病毒（“SCrV”）、斑驳病毒（“SMoV”）等4种主要病毒，均具有难以分离、纯化的特点。针对这一特点，课题组采用多重RT-PCR同步快速检测技术，对草莓试管苗进行高灵敏度的病毒检测，该技术无需分离、纯化，就能快速对草莓组培试管苗或植株进行是否带有这4种主要病毒以及带有其中的哪一种病毒的快速检测和鉴别。

3.2 组培苗炼苗移栽 组培瓶苗长至10cm后，直接打开培养瓶盖，加入少量纯净水，水量以高过培养基2cm为宜，定時观察续水，7d后用温水将幼苗根部的培养基充分洗净。然后，放入装有10ml1/2MS+IAA 0.3mg/L水溶液的三角瓶中，15d后移栽至苗床。宜选105孔的标准穴盘作苗床；栽植基质宜采用按1∶1∶1的比例混合的草炭、蛭石、珍珠岩混合基质，发挥其蓄水保肥性强、透气性好的优势。移栽前要让基质充分吸足水分，并消毒处理，以防苗期病害危害。移栽时，宜轻取轻放、控制力度，避免损伤幼苗嫩茎。移栽后，及时覆膜保湿，每天中午揭膜透气，后期宜逐步揭开，防止幼苗失水萎蔫。

3.3 草莓无病毒苗繁育 在草莓无病毒苗繁育过程中，最为重要的是防止病毒感染。原种苗繁育过程中要防止蚜虫和叶蝉为害传毒，宜选择网室内繁育。生产用种苗要在隔离条件下的专用苗圃内繁育，离周围草莓种植地至少3km。避免用栽过草莓的重茬地繁育草莓无病毒苗，并注意定期防治蚜虫、叶蝉为害。草莓无病毒苗的繁育主要采用匍匐茎繁殖法，其分生量大、速度快、苗质量好。在浙北，匍匐茎的开始期在5月下旬，发生高峰期在6—7月上中旬，可一直延续到8月中旬。为获得更多的健壮匍匐茎苗，前期要加强管理：一是要在匍匐茎苗发生前期，及时追肥、灌水、松土、除草；匍匐茎大量发生时，宜用人工拔除杂草。二是要及时疏花，疏去整个花序，抑制生殖生长，促进营养生长。三是要及时对母株基部壅土、培土，培土厚度以埋住新根而露出苗心为宜。8月下旬开始，要控制草莓植株生长，防止长势过旺。

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（责编：徐焕斗）endprint