黄芩苷对猪链球菌体外抗菌活性试验

王 留 刘秀玲 梁 博

（商丘职业技术学院，河南商丘 476100）

黄芩是我国传统中药，是唇形科多年生草本植物黄芩的干燥根，始载于《神农本草经》，其性寒味苦，可除湿、止血安胎、治疗肺热、咳嗽、湿热、黄痘等，具有抗菌、抗炎、抗变态反应、抗氧化等作用。黄芩苷是从中药黄芩的干燥根中提取分离得到的一类黄酮类化合物，属葡萄糖醛酸苷类，也是黄芩中药材中含量最多的黄酮类化合物，含量高达12.1%。药理研究已证明，黄芩苷具有清热镇静、抑菌抗炎、抗氧化等多方面作用[1-2]。本研究通过体外试验测定黄芩苷对猪溶血性链球菌的最小抑菌浓度、生长曲线和溶血素活性抑制等试验，探讨黄芩苷对猪溶血性链球菌的抗菌作用及机制，为开发用于猪链球菌病治疗的黄芩新兽药制剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物

黄芩苷，购于四川天然药物有限公司，含量85%，为淡黄色结晶粉末。用二甲基亚砜配置成12.8 mg·mL-1的溶液备用。

1.2 试验菌株及培养基

猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株、Todd-Hewitt肉汤培养基（THB）、无菌脱纤维兔血购于上海索尔生物科技有限公司。THB培养基按说明书配制，121℃高压灭菌后备用。

1.3 黄芩苷最小抑菌浓度测定

采用微量稀释法[3]测定黄芩苷对猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株的最小抑菌浓度（MIC），经2倍倍比稀释后，黄芩苷的终浓度分别为1 280、640、320、160、80、40、20、10 μg·mL-1。试验重复 3 次，取 3次试验结果的平均值作为黄芩苷对猪链球菌2型的MIC。

1.4 猪链球菌生长曲线测定

参考张伟等[4]文献报道的方法，猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株接种于100 mL THB培养基中振荡培养（37℃，200 rpm）至对数生长前期（OD600nm＝0.3），分装于5个50 mL锥形瓶中，每瓶15 mL。分别在5个锥形瓶的猪链球菌培养物中加入黄芩苷溶液，使培养液中黄芩苷的终浓度分别为0、8、16、32、64 μg·mL-1，继续培养至5 h，期间每隔0.5 h分别测定每瓶猪链球菌培养物的OD600nm光密度值，绘制猪链球菌的生长曲线。

1.5 猪链球菌溶血素活性抑制试验

猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株接种于100 mL THB培养基中振荡培养（37℃，200 rpm）至对数生长前期（OD600nm＝0.3），分装于5个50 mL锥形瓶中，每瓶15 mL。分别在5个锥形瓶的猪链球菌培养物中加入黄芩苷溶液，使培养液中黄芩苷的终浓度分别为0、8、16、32、64 μg·mL-1，继续培养至对数生长后期。分别将每瓶猪链球菌培养物10 000 rpm高速冷冻离心1 min，分离上清液。分别在1.5 mL离心管加入磷酸盐缓冲液（PBS）875 μL、猪链球菌培养物上清液100 μL、脱纤维兔红细胞25 μL，混匀，37℃培养箱内静置0.5 h，然后10 000 rpm高速冷冻离心1 min，分离上清液，测定上清液的OD450nm光密度值。

2 结果与分析

2.1 黄芩苷最小抑菌浓度

试验结果显示，黄芩苷对猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株的最小抑菌浓度大于1 280 μg·mL-1，说明黄芩苷对猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株抑菌效果较差。黄芩苷是从中药黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有广泛的药理活性和生物学功能[1]。陈功义等[5]采用细胞模型试验研究了黄芩苷对猪细小病毒感染猪肾细胞的体外作用，结果显示黄芩苷能够显著阻断猪细小病毒感染猪肾细胞，对猪细小病毒引起的细胞病变有一定的抑制作用，阻断和抑制效应与黄芩苷的浓度梯度呈正相关。闫静等[6]体外试验结果表明，黄芩苷能够干扰病毒的复制和阻滞病毒的侵入，能有效抑制传染性法氏囊病毒感染鸡胚成纤维细胞。杨静[7]采用微量稀释法研究了黄芩苷对猪常见致病菌的最小抑菌浓度，结果表明黄芩苷对猪大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗菌活性，对链球菌抗菌效果较差，对沙门氏菌和巴氏杆菌无明显的抗菌作用。魏滋鸿等[8]、张伟等[9]、刘通等[10]分别研究了黄芩提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌的抗菌作用，结果提示黄芩提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用。本试验结果显示黄芩苷对猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株抑菌效果较差。

2.2 黄芩苷对猪链球菌生长曲线的影响

猪链球菌生长曲线见图1，试验显示黄芩苷在0～64 μg·mL-1的浓度范围内对猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株的生长无抑制作用。魏滋鸿等[8]、张伟等[9]、刘通等[10]分别研究了黄芩提取物对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，结果提示黄芩提取物在0～64 μg·mL-1浓度范围内对单增李斯特菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌的生长无抑制作用，本试验结果与其相一致。

2.3 黄芩苷抑制猪链球菌溶血素活性

黄芩苷抑制猪链球菌溶血素活性试验结果见表1，结果表明黄芩苷与猪链球菌2型SS2 ATCC 43765参考菌株共培养后，能够显著抑制培养物上清液中猪链球菌溶血素的溶血活性，黄芩苷添加浓度为32～64 μg·mL-1时，猪链球菌溶血素活性与对照组（0 μg·mL-1组）相比差异显著。溶血素是猪链球菌2型细菌产生的一种外毒素，具有溶血和细胞毒性，是猪链球菌的主要毒力因子，对猪链球菌的感染和免疫都有重要影响，破坏溶血素的溶血活性是降低猪链球菌致病力的主要治疗措施之一。张伟等[9]、李根等[11]、陈庆忠等[12]分别研究了黄芩提取物、药桑提取物、银杏叶提取物对猪链球菌溶血素活性的影响，试验结果显示黄芩提取物、药桑提取物、银杏叶提取物均可显著抑制猪链球菌溶血素介导的溶血活性，本试验结果与其相一致。

表1 黄芩苷对猪链球菌溶血素活性的抑制作用