抑制酸奶后发酵桑叶活性成分筛选及桑叶黄酮酸奶工艺

成少宁 ，王芬 ，乔冬 ，董文宾 ，2，黄健 ，3

（1.运城职业技术大学，山西运城044000；2.陕西科技大学，西安710021；3.运城学院，山西运城044000）

0 引 言

桑叶是桑树的干燥叶，富含多种人体所需的营养物质和生物活性物质，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种功效[1]，《本草纲目》记载“桑之功最神，在人资用尤多”[2]。现代医学研究表明，桑叶可以改善肥胖[3]，其含有的活性物质都具有降血糖成分[4]，是开发保健食品、功能食品乃至药品的良好材料来源。

酸奶是人们非常喜爱的食品之一，而在运输、售卖及贮藏的过程中，很难做到冷藏，导致贮藏后期酸奶的酸度过高，口感不佳，桑叶粉对后发酵具有一定的抑制作用[5]，本研究主要筛选对抑制酸奶后发酵影响最大的桑叶活性成分，并优化桑叶活性成分酸奶工艺，为桑叶的深加工乃至桑叶相关功能性食品的开发提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

桑叶多糖、桑叶总黄酮、桑叶生物碱，实验室提取并保存；鲜牛奶，南山牧场；白砂糖，市售；德式乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌，本学院微生物实验室；大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限公司；氢氧化钠（分析纯），广州光华公司。

1.1.2 仪器设备

GNP-9160 隔水式电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；GYB40-10S 高压均质机，上海东华试验仪器设备有限公司；SW-CJ-2D 超净工作台，苏州净化设备有限公司；1/10000g 220gCPA224S 电子分析天平，德国赛多利斯有限公司；DHG-9203A 电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；PB-10pH 计，德国赛多利斯有限公司；TGL-16G 高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 抑制酸奶后发酵桑叶活性成分筛选

1.2.1.1 酸奶制作流程与操作要点：

鲜牛乳检验：鲜牛乳要求色泽乳白、无异物、无凝块、具有鲜乳固有的香味，经过无菌纱布过滤除杂，按照GB 19301-2010《食品安全国家标准生乳》要求的方法检验其蛋白质、脂肪、杂质度、非脂乳固体、微生物等指标，检验结果均符合国标要求的鲜牛乳作为酸奶发酵的原料乳。

均质、杀菌：鲜牛乳、7%白砂糖、0.4%桑叶活性物质，混合均匀后在均质机中60 ℃、20 MPa均质5 min。

杀菌：90～95 ℃杀菌10 min。

菌种活化：分别将实验室中保存的德式乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌试管菌种接种于10%的无菌脱脂乳培养基中42 ℃培养并反复活化，直到活力达到规定要求为止。

冷却、接种：杀菌后将牛乳快速冷却至42～45 ℃，加入活化后的菌种，混匀。

发酵、冷藏后熟：42 ℃发酵4 h，待酸牛乳冷却至室温后，放入4 ℃的冰箱中后熟24 h，即为酸牛乳成品。1.2.1.2 酸度测定

参照 GB 5009.239-2016 中的第二法 pH 计法[6]对三种活性成分酸奶和对照酸奶贮藏1，5，9，13，17，21 d的酸度进行测定。精确称取10 g 搅拌均匀的酸奶，置于150 mL 锥形瓶中，加入20 mL 蒸馏水，用0.1 moL/L的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液pH 值稳定在8.30±0.01 处4～5 s，并在这一过程中始终用磁力搅拌器进行搅拌。记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，按照公式计算其滴定酸度。

1.2.1.3 pH 值

用 pH 计检测贮藏 1，5，9，13，17，21 d 的3 种活性成分酸奶和对照酸奶。

1.2.1.4 持水力

采用重量法[7]，取20 mL 的干燥空离心管质量计为W1，分别向其中加入10 g 左右酸奶，精确称量质量计为W2，转速4 000 r/min 离心10 min，小心吸出上清液，精确称量后计为W3，持水力为=

1.2.1.5 乳酸菌总数测定

按照GB 4789.35-2016 方法[8]分别计数嗜热链球菌数和乳杆菌数，两者之和即为乳酸菌总数。

1.2.2 最佳发酵工艺条件的确定

以发酵剂接种量、蔗糖添加量、活性成分添加量以及果胶添加量4 个因素进行单因素试验，确定每个因素发酵的水平，通过响应面进行优化[9]，确定活性成分酸奶的最佳发酵工艺条件。

1.2.2.1 感官评价

抽选食品专业经过培训的10 名学生，对各酸奶进行组织状态、色泽、口感、风味的评价和打分，满分100分，评分标准如表1所示。

表1 酸奶感官评分标准

2 结果与分析

2.1 抑制后发酵桑叶活性成分筛选

2.1.1 桑叶活性成分对酸奶贮藏期酸度的影响

桑叶3 种活性成分对酸奶贮藏期酸度的影响如图1所示。

图1 桑叶活性成分对酸奶贮藏期酸度的影响

由图1 可知，桑叶活性成分酸奶滴定酸度在贮藏前期1～9 d 均随着贮藏天数的增加而增加，但是在贮藏后期13～21 d 随着贮藏天数增加滴定酸度减小，而且在贮藏期3 种活性成分中桑叶生物碱的滴定酸度最高，桑叶黄酮最低，说明桑叶生物碱能促进桑叶酸奶的发酵，桑叶多糖和黄酮在初期能促进发酵，但是后期可能会抑制发酵，导致滴定酸度降低，桑叶黄酮抑制酸奶后发酵的作用较其他两种活性成分强，对照酸奶的滴定酸度在贮藏期均呈增加趋势。

2.1.2 桑叶活性成分对酸奶贮藏期pH 值的影响

桑叶活性成分对酸奶贮藏期pH 值的影响如图2所示。

由图2可知，活性成分酸奶的pH 值贮藏前期都随着贮藏天数的增加而减小，贮藏后期则有缓慢的上升，其中桑叶生物碱的pH 值最小，桑叶黄酮在贮藏初期（1～5 d）pH 值小于桑叶多糖，但是后期（9～21 d）pH值大于桑叶多糖，对照酸奶的pH 值则随着贮藏天数的增加呈下降趋势。pH 值的变化趋势与滴定酸度基本相同，都为桑叶黄酮的抑制发酵作用最强。

2.1.3 桑叶活性成分对酸奶贮藏期持水力的影响

桑叶活性成分对酸奶贮藏期持水力的影响如图3所示。

图3 桑叶活性成分对酸奶贮藏期持水力的影响

由图3 可知，桑叶在贮藏期持水力基本都呈下降趋势，持水力反映了酸奶的组织状态，说明酸奶随着贮藏天数的增加其组织状态会变差，会有更多的乳清析出。桑叶生物碱的持水力最大，桑叶黄酮次之。

2.1.4 桑叶活性成分对酸奶贮藏期乳酸菌总数的影响

桑叶活性成分对酸奶贮藏期乳酸菌总数的影响如图4所示。

图4 桑叶活性成分对酸奶贮藏期乳酸菌总数的影响

由图4 可知，3 种活性成分酸奶的乳酸菌数都高于对照酸奶，说明桑叶活性成分均能促进酸奶中乳酸菌数的增值，并且均呈现先升高后降低的趋势，其中桑叶生物碱酸奶的乳酸菌数最高，并且在贮藏17 d 时达到最高，之后又迅速下降，桑叶多糖的乳酸菌数和桑叶黄酮的乳酸菌数数量和变化趋势都相近，但是桑叶多糖的乳酸菌数在第13 d 达到最大，桑叶黄酮的乳酸菌数在第17 d达到最大。其中的机理还需进一步研究。

综合以上检测结果，桑叶黄酮酸奶在3 种活性成分酸奶中的滴定酸度最低，pH 值在贮藏后期最高，持水力和乳酸菌数虽然都小于生物碱，但是生物碱由于其滴定酸度太高，对酸奶后发酵不能起到抑制作用，所以桑叶黄酮是3 种活性成分中对酸奶后发酵抑制作用最大的活性成分。

2.2 最佳发酵工艺条件的确定

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 发酵剂添加量对桑叶黄酮酸奶发酵的影响

在蔗糖添加量为7%，桑叶黄酮添加量为0.5%，果胶添加量为0.2%，发酵剂添加量分别按照1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%在42 ℃恒温条件下发酵4 h，然后测定其滴定酸度和感官，结果如图5所示。

图5 发酵剂接种量对酸奶发酵的影响

由图5 可知，酸奶酸度随着发酵剂接种量的增加呈上升趋势，说明发酵剂接种量越多，发酵的速度越快，但是感官评分在发酵剂接种量为2.00%时最高，发酵剂接种量大于2.00%时，酸度太高，感官评分下降。

在发酵剂添加量为2.0%，桑叶黄酮添加量为0.5%，果胶添加量为0.2%，蔗糖添加量分别按照3%，5%，7%，9%，11%在42 ℃恒温条件下发酵4 h，然后测定其滴定酸度和感官，结果如图6所示。

图6 蔗糖添加量对酸奶发酵的影响

由图6 可知，酸奶酸度随着蔗糖添加量的增加而增加，说明蔗糖可以促进酸奶的发酵，因为蔗糖可以作为乳酸菌的碳源促进乳酸菌的生长从而有助于酸奶酸度的增加，而感官评分在蔗糖添加量9%时最高，添加量大于9%酸度过高，酸甜不协调，感官评分下降。

2.2.1.3 桑叶黄酮添加量对桑叶黄酮酸奶发酵的影响

在蔗糖添加量为7%，发酵剂添加量为2.0%，果胶添加量为0.2%，桑叶黄酮添加量分别按照0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%在42 ℃恒温条件下发酵4 h，然后测定其滴定酸度和感官，结果如图7所示。

图7 桑叶黄酮添加量对酸奶发酵的影响

由图7 可知，酸奶的滴定酸度和感官评分都随着桑叶黄酮添加量的增加而呈现先增加后降低的趋势，黄酮在低浓度时会促进酸奶发酵，但是高浓度的黄酮可能会抑制酸奶的发酵，导致酸奶的滴定酸度下降，添加量在0.70%时都达到最大值。

2.2.1.4 果胶添加量对桑叶黄酮酸奶发酵的影响

在蔗糖添加量为7%，发酵剂添加量为2.0%，桑叶黄酮添加量为0.5%，果胶添加量分别按照0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%在42 ℃恒温条件下发酵4 h，然后测定其滴定酸度和感官，结果如图8所示。

图8 果胶添加量对酸奶发酵的影响

由图8 可知，果胶添加量对酸奶发酵的影响较小，随着果胶添加量的增加，酸奶的酸度变化影响较小，但是感官影响较大，因为果胶会影响酸奶的组织状态，添加量低时，搅拌后酸奶组织较稀薄，添加量太高，酸奶又太稠，添加量0.2%时感官评分最高。

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2.2.2 响应面法优化桑叶黄酮发酵工艺条件

2.2.2.1 响应面实验设计及结果

根据单因素实验的结果，运用Box-Behnken 实验设计原理，选取发酵剂添加量（A）、蔗糖添加量（B）、桑叶黄酮添加量（C）、果胶添加量（D）为影响因素，以感官评分为评价指标，进行4 因素3 水平的响应面分析。试验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计及结果 %

利用Design-Expert V8.0.6 软件，对试验结果进行多元二次拟合分析，以及方差分析结果如表3所示。

对实验数据进行多元二次回归拟合，得到回归模型方程为

Y=92.10+0.83A+0.73B-1.34C+0.058D+0.40AB+0.13AC-0.63AD+0.25BC-0.050BD-0.30CD-2.32A2-1.29B2-3.95C2-2.05D2。

由表3 可知，该模型具有极显著性（P＜0.01），说明响应面模型极度显著，具有统计学意义，同时失拟误差为0.8969（P＞0.05）不显著，其多元相关系数为R2=0.9120，表明所建立的回归模型的拟合度为91.20%；说明该模型预测值与实际试验值拟合较好，可以将该模型用于桑叶黄酮酸奶的工艺研究。

由表3 可以看出，各试验因素对桑叶黄酮酸奶品质的影响排序为桑叶黄酮添加量（C）＞发酵剂添加量（A）＞蔗糖添加量（B）＞果胶添加量（D）。

2.2.2.2 响应面分析讨论

利用响应面Design-Expert V8.0.6 软件处理的交互作用结果见图9～图11所示。

图9 桑叶黄酮添加量与发酵剂添加量交互作用响应面

图10 果胶添加量与发酵剂添加量交互作用响应面

图11 桑叶黄酮添加量与果胶添加量交互作用响应面

通过响应面分析可知，对活性成分酸奶感官评价影响最大的交互作用是因素A 和因素D，即发酵剂添加量和果胶添加量，其响应面如图10 所示。当果胶添加量为0.18%～0.23%，发酵剂添加量为1.7%～2.3%时，响应面值接近最高点，说明在这个范围内，活性成分酸奶的感官品质较好。

通过Design-Expert V8.0.6 软件分析得出其最佳的工艺条件为：发酵剂添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑叶黄酮添加量0.67%，果胶添加量0.20%，在此条件下感官评分预测值为92.3994。

根据预测的最佳工艺条件，即发酵剂添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑叶黄酮添加量0.67%，果胶添加量0.20%，进行桑叶黄酮发酵酸奶工艺的验证实验，得到其感官评分为91.6，与预测值较接近，说明利用响应面优化得到的工艺条件可行。

3 结 论

（1）试验通过测定桑叶3 种活性物质酸奶在贮藏期的滴定酸度、pH 值、持水力和乳酸菌数的变化来筛选对酸奶后发酵具有抑制作用的物质，结果显示桑叶多糖和桑叶黄酮对酸奶后发酵都具有抑制作用，桑叶黄酮的抑制作用最强，桑叶生物碱对酸奶后发酵没有抑制作用。

（2）采用Box-Behnken 响应面优化的方法，以感官评价为指标，优化得到桑叶黄酮酸奶的最佳发酵工艺为：发酵剂添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑叶黄酮添加量0.67%，果胶添加量0.20%。以此工艺和配方，生产桑叶黄酮酸奶，其感官评价分数预测最大值为92.3994，实测值为91.6，生产的桑叶黄酮酸奶色泽微黄，表面有细腻均匀光泽，无沉淀分层，有少量的乳清析出，入口有浓郁的桑叶清香，并且与乳香柔和，酸甜适口。