载脂蛋白E基因526 C>T多态性与氟伐他汀调脂作用的相关性分析

李汶嘉 杨伟 罗丹

血脂是生命细胞基础代谢的必需物质，广泛分布在人类机体中，主要包括血浆中的中性脂肪和类脂，其中前者包括甘油三酯(TG)，后者包括类固醇、固醇、糖脂及磷脂等[1]。血脂异常是冠心病和脑梗死等疾病的危险因素。氟伐他汀属临床常见药物，是目前已知的第一个全化学合成的降胆固醇药物，主要作用于肝脏，其药代动力学为非线性，即可刺激低密度脂蛋白(LDL)受体的合成和提高其微粒摄取等[2-3]。载脂蛋白E(ApoE)是常见血浆脂蛋白的重要成员之一，是维持人类正常脂质代谢的重要物质，存在多种脂蛋白中，人体中ApoE通过结合LDL受体(LDLR)以调节脂质代谢。既往临床研究证实，他汀类药物利用竞争性结合羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性调节体内血脂水平，而ApoE基因多态性可影响他汀类药物的调脂效果[4]。这可能是不同亚型的ApoE基因结合LDLR能力存在差异导致，但这种差异是否同时造成HMG-CoA还原酶活性的改变尚未完全明确。本研究主要探讨ApoE基因526 C>T多态性与氟伐他汀调脂作用的相关性。

对象与方法

1.对象：纳入2015年1月～2018年1月我院收治的血脂异常患者152例，根据氟伐他汀治疗效果将其分为疗效良好组(A组，87例)、疗效正常组(B组，42例)、疗效不良组(C组，23例)；根据基因检测结果将其分为E2组(E2/E2和E2/E3基因型)37例、E3组(E3/E3和E3/E4基因型)110例、E4组(E2/E4和E4/E4基因型)5例。氟伐他汀标准品购于海正辉瑞制药有限公司(国药准字H20070168，规格：40 mg，含量>97.0%)，二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)购于上海健超化学科技有限公司。二辛可宁酸法(BCA)蛋白检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)相关试剂和总RNA提取试剂均购于北京全式金公司。PCR扩增仪购于杭州朗基科学仪器有限公司，全波长酶标仪、凝胶成像仪等均购于美国Bio-RAD公司。人体正常肝细胞(NFHH)和人皮肤成纤维细胞(HSF)均由美国典型菌种保藏中心(ATCC)提供，其中NFHH为L-02，5～15代，HSF为10～20代。

2.方法

(1)DNA提取和ApoE基因检测：所有患者均抽取静脉血5 ml，采用人血DNA提取试剂盒提取DNA后，利用PCR-荧光探针法检测3组患者的ApoE基因。

(2)氟伐他汀标准品贮备液制备：精确称取氟伐他汀标准品25.0 mg与二甲基亚矾(DMSO)5 ml配制成贮备液(5 mg/ml)后置于-20 ℃冰箱中保存，于临用前稀释。

(3)ApoE-DMPC复合物制备：取10 mg DMPC标准品溶于1 ml的氯仿/甲醇(3∶1)中，待其挥发干燥后加入0.05 mol/L氯化钠溶液0.15 g/ml、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(pH=7.6)缓冲液1 ml及HCl配置成1 mmol/L溶液，随后将其置于30 ℃的超声下处理0.5 h。待上述步骤完成后，将100 mg的ApoE溶于1 ml上述缓冲液中，然后将其加入超声处理后的DMPC溶液50 μl中混匀，在常温下过夜待用。最后将其保存于4 ℃冰箱中待用，临用前稀释处理。

(4)氟伐他汀与L-02细胞株的毒性试验：采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测不同浓度氟伐他汀标准品对L-02细胞活性的影响。

(5)PCR反应体系：cDNA 4 μl、Supermix 12.5 μl及引物各1 μl加入ddH2O中配制至25 μl；随后将HMG-CoA还原酶cDNA与Supermix各3 μl、12.5 μl及引物各1 μl再次加入ddH2O中配制至25 μl待用。引物序列见表1。

表1 引物序列

(6)PCR反应条件：LDLR、HMG-CoA还原酶的预变性、变性、退火、延伸条件见表2，上述4个步骤均30个循环后再延伸(温度：72 ℃，时间：10min)，随后将其置于4 ℃冰箱中保存待用。

表2 PCR反应条件

(7)ApoE基因多态性与LDLR结合的相关性：将处于对数生长期的HSF细胞接种于24孔板，每孔接种约5×104个细胞，待其长满后在无血清培养基上诱导LDLR活性，24 h后弃去上述培养基，然后在无血清培养基上加入20 μg/ml的LDL和ApoE-DMPC复合物1 ml并确保每孔中的LDL终浓度均为10 μg/ml，而ApoE终浓度分别为0 μg/ml、0.12 μg/ml、0.25 μg/ml、0.50 μg/ml、1.00 μg/ml、2.00 μg/ml。每孔设3个复孔，将上述配制好的LDL、ApoE终浓度溶液置于4 ℃下结合120 min。然后每孔取上清液500 μl以1 000 r/min离心10 min后取上清液并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测未结合的LDL，采用BCA法检测裂解细胞的蛋白质含量。各等位基因与SNPs、基因型与检测位点的对应关系见表3。

表3 各等位基因与SNPs、基因型与检测位点的对应关系

(8)LDLR mRNA、HMG-CoA还原酶mRNA表达水平的检测：将处于对数生长期的L-02细胞接种于24孔板，每孔接种约5×104个细胞。直至细胞贴壁，然后用无血清的培养基诱导120 min。根据不同组别配制待检溶液(表4)，配制要求均按MTT实验操作执行，其中各药实验浓度均按半抑制浓度(IC50)配制，每组设3个复孔。加药成功24 h后提取5组细胞的总RNA，采用RT-PCR检测HMG-CoA还原酶和LDLR mRNA的表达水平。

表4 不同组别的培养基配制情况

结 果

1.ApoE不同基因型对竞争性结合LDLR能力的影响：E2组、E3组、E4组的LDLR最大置换量分别为(3.89±0.37)μg/mg、(6.87±0.22)μg/mg、(6.12±0.34)μg/mg，其中E3组明显高于E2组和E4组，E4组明显高于E2组(P<0.05)。

2.152例血脂异常患者ApoE等位基因和基因型频率检测结果：152例血脂异常患者中，ApoE等位基因E3出现的频率高于E2和E4(P<0.05)，而ApoE等位基因E2和E4出现的频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 152例血脂异常患者ApoE等位基因和基因型频率检测结果

3.患者不同ApoE基因型分布情况及E2组、E3组、E4组疗效优良率比较：A组、B组、C组患者不同ApoE基因型分布情况见表6。疗效优良包括疗效良好和疗效正常。E2组、E3组、E4组疗效优良率分别为19.74%(30/152)、55.92%(85/152)、9.21%(14/152)，其中E2组高于E3组、E4组(P<0.001)。

表6 A组、B组、C组患者不同ApoE基因型分布情况[例，(%)]

讨 论

从目前的研究结果而言，ApoE基因在人体中有显著的遗传多态性，相对常见的异构体包括ApoE2、ApoE3、ApoE4，其中突变型为ApoE2、ApoE4，而野生型为ApoE3。有学者采用多重单碱基延伸(SNaPshotSNP)技术检测发现，转铁蛋白(TF)、胆固醇24 s-羟化酶(CYP46)及ApoE等基因均有显著的多态性，且种族差异不明显。ApoE是一种常见的碱性蛋白，富含精氨酸，由299个氨基酸残基构成[6]，由肝脏中的肝实质细胞(PMC)和脑组织中的星形胶质细胞合成。据统计，ApoE作为LDLR的配体之一，其与血浆中TG和胆固醇的运输及代谢明显相关，故临床上将其作为脂类代谢及心血管疾病的主要决定分子。既往研究结果显示，ApoE不仅参与机体的免疫调节和神经组织再生，还参与水解脂肪酶类的激活和血小板聚集的抑制等[7]。

本研究结果显示，E3组LDLR最大置换量高于E2组和E4组，且E4组高于E2组，提示E2、E4突变基因在LDLR中的竞争性结合力较E3低，且E2低于E4。在人体的各种细胞和组织中，如血管平滑肌细胞、肝细胞及成纤维细胞等中均有一定量的LDL分布。本研究选用HSF细胞的原因为LDLR直接与机体中的LDL相关。本研究结果显示，ApoE不同基因型均可在HSF上的LDLR结合，但ApoE的结合力较LDL更强。与之对应的是，ApoE受体活性越大时，LDL被置换出来的比例也越高，提示ApoE受体活性与LDL被置换率呈正比。另外，本研究中ELISA检测结果显示，本次纳入的细胞培养基中同样有ApoE未与细胞的LDLR结合。有学者通过间接法比较ApoE2、ApoE3、ApoE4的竞争性结合实验后证实，随着LDL浓度递增，不同基因型的ApoE与LDLR结合的能力越低，即越接近饱和，这与本研究结果相对接近[8]，表明突变型E2、E4的受体结合活性较野生型ApoE(E3)低，突变型E2最低。上述研究结果间接证实，采用LDLR检测血脂异常人群的ApoE2具有敏感性高、特异性强和操作简便等优势。相关研究也证实上述方法在检测大样本时同样具有上述特点[9]。本研究152例血脂异常患者中，ApoE2、ApoE3、ApoE4等位基因的频率分别为15.46%、63.82%和20.72%，E2/E2、E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4、E4/E4基因型的频率分别为1.32%、14.47%、2.63%、60.53%、11.84%和0.66%，表明ApoE2基因多态性与氟伐他汀的相关性较ApoE3低，ApoE3基因多态性与氟伐他汀的相关性较ApoE4高，而ApoE2基因多态性与氟伐他汀的相关性与ApoE4比较差异无统计学意义，其原因可能为人体中的精氨酸与半胱氨酸突变或多或少地降低ApoE2基因多态性，这与相关文献[10]报道的ApoE2基因有缺陷基本相符。

本研究结果显示，E2组的疗效优良率高于E3组、E4组，表明在对血脂异常人群的临床治疗过程中，合理地给予氟伐他汀治疗有较好的降脂疗效。当然也提示ApoE2基因多态性与疾病严重程度可能存在联系，即疾病治疗时的降脂效果越好，ApoE2基因的多态性越低。简言之，氟伐他汀的降脂作用强弱与ApoE2基因多态性呈反比，但二者之间的具体作用机制尚未明确。氟伐他汀的作用部位在肝脏，既往临床研究结果证实，氟伐他汀不仅对内源性胆固醇的合成有抑制作用，还可使肝细胞内的胆固醇含量降低，刺激LDLR合成并使LDL微粒摄取提高[11]。还应注意的是，氟伐他汀同样可降低血浆总胆固醇水平。

从本研究结果而言，ApoE2基因多态性与氟伐他汀调脂作用的相关性可能与以下原因有关：(1)ApoE2基因多态性作为常见的位点C等位基因在一定程度上可减弱OATP1B1的转运功能[12]，氟伐他汀较辛伐他汀的脂溶性更低，继而不容易分布于人体的肌肉组织或引起相关疾病。(2)ApoE2基因多态性决定了人体肝细胞转运体对氟伐他汀的转运效率有一定的调控机能[13]，其在机体正常或异常不显著的状态下产生的不良反应更低。(3)氟伐他汀可有效抑制HMG-CoA还原酶的表达效能，这与ApoE基因突变位点可减少LDL置换量，从而促使HMG-CoA还原酶呈高表达有关[14]；但近年来的研究结果又证实，HMG-CoA还原酶受ApoE2的抑制作用极低，而当ApoE4存在时，机体中丹参素的抑制效能较无ApoE4时更明显，这可能与丹参素和突变型E4、氟伐他汀和突变型E2在机体中形成某种尚未发现的复合物而使氟伐他汀在血脂异常人群中的整体治疗效果被抑制有关[15]，也提示ApoE2基因多态性与氟伐他汀的调脂作用具有相关性。

综上所述，对于血脂异常而应用氟伐他汀治疗者，ApoE基因526 C>T多态性对氟伐他汀有较好的降脂效能，可在检测ApoE基因526 C>T多态性和获取相关数据的基础上制定相关的氟伐他汀治疗方案以降低不良反应的发生率。