城市生活垃圾堆放对土壤细菌群落结构和功能的影响

张子赟 何欣樾 王明皓 石娟 张天尧 周家旺 高楠 马超

摘 要：為探究城市生活垃圾堆放对土壤微生物群落结构的影响，通过扩增子测序技术，对垃圾堆放处表层深度20cm的土壤（处理组）和距离垃圾堆放处5m以外同样深度的土壤（对照组）细菌群落结构进行了分析及功能预测。结果表明：对照组和处理组分别得到55935和47812条有效序列;相较于对照组，处理组的土壤细菌丰富度（chao1）降低24.06%，细菌多样性（shannon）降低17.84%;在细菌门分类水平上，2组土壤的优势门类均为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria），但相对丰度具有显著差异，其中处理组厚壁菌门相对于对照组增加43.68%，绿弯菌门减少8.58%;优势属类为芽孢杆菌属（Bacillus）、虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus），其中芽孢杆菌属相对丰度最高，处理组相对于对照组增加26.56%;PICRUSt预测结果表明，6个代谢通路中有46个KEGG二级功能群，其中碳水化合物代谢为2组样品在二级功能群的优势功能，有垃圾覆盖对功能基因丰度及多样性影响不显著。由此可见，垃圾堆放对土壤细菌丰度和多样性产生负面影响，对细菌群落的相对丰度具有显著影响，对功能无明显影响，此结果阐明了优化垃圾处理方法的重要性。

关键词：生活垃圾;土壤微生物;16S rRNA测序;PICRUSt功能预测;合肥方兴社区

中图分类号 S154.3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）20-0123-05

Influence of Municipal Solid Waste Stacking on Soil Bacterial Community Structure and Function

ZHANG Ziyun1 et al.

（1Anhui Province Key Lab of Farmland Ecological Conservation and Pollution Prevention，School of Resources and Environment，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Abstract： To explore the influence of municipal solid waste stacking（MSWS）on the soil microorganism，the soil bacterial community structure and function of soil sampled from the garbage dump（treatment）and soil sampled from the palce 5m away from the garbage dump（control）was analyzed by 16srRNA sequencing and PICRUSt. The results showed that： compared with the control， the soil bacteria richness（chao1）in the treatment group decreased by 24.06%， and the bacteria diversity（Shannon）decreased by 17.84%. The dominant soil microbial communities at the phylum level were Proteobacteria，Chloroflexi， Acidobacteria and Actinobacteria，but their relative abundance was significantly different. Compared with the control， Firmicutesand Chloroflexiof treatment was increased by 43.68% anddecreased by 8.58%，respectively. The dominant genera were Bacillus and Fictibacillus，while the Bacillus occupied the hightest species richness. Compared with the control， Bacilluswas increased by 26.56%.PICRUSt analysis demonstrated that there were 46 subfunctional groups from 6 metabolic pathways were determined in the soil bacterial gene sequences. Among these functions， carbohydrate metabolism was the main metabolic function groups in the bacterial communities，and garbage coverage had no significant influence on the abundance and diversity of functional genes. In conclusion，garbage stacking had significant negative effect on the abundance and diversity of soil bacteria community，but had no effect on their function.

Key words： Domestic garbage;Soil microorganism; 16S rRNA sequencing; PICRUSt function prediction; Fangxing community in Hefei

随着经济的迅速发展、城市化进程的加快，城市生活垃圾产生量迅速增长，垃圾处理工作压力持续增加。安徽省16市城镇每天生活垃圾产生量为27130.3t，其中以合肥市每天产生的生活垃圾最多，可达5302t[1]。目前，合肥市处理垃圾的方法比较单一，多为填埋或直接堆放，堆放过程中会产生含有大量有机物、氨氮元素、重金属离子、漂浮物和致病细菌的渗滤液，通过雨水冲刷对土壤造成污染[2]。因此，研究生活垃圾堆放下土壤细菌的组成和多样性，对改善生活垃圾处理方式、减少垃圾堆放引起的环境污染具有重要意义。

早期生活垃圾堆放对土壤的影响研究主要关注土壤理化性状和重金属含量[3，4]。例如，席北斗等[3]研究证明生活垃圾长期堆放导致周边土壤理化性质发生改变，距离堆体最近处土壤硝化速率和呼吸速率明显提高;李永霞等[4]通过研究山东省某近郊生活垃圾土壤，发现堆体下土壤重金属含量高。也有少数学者研究了生活垃圾堆放对土壤微生物性状的影响。例如，谢冰等[5]利用PCR-DGGE技术研究东北地区垃圾堆放对不同深度土壤微生物多样性的影响，结果表明土壤深层的微生物多样性高于土壤表层。然而，由于前期土壤微生物性状分析技术的限制，生活垃圾堆放对土壤微生物群落结构的影响一直没有得到系统和完备的解析[6]。随着高通量测序的不断发展，利用扩增子测序技术，不仅可以准确分析土壤微生物群落的组成状况，还可以对其功能进行预测[7]。因此，利用扩增子测序技术探究生活垃圾堆放对土壤微生物群落结构的影响十分必要。笔者通过采集生活垃圾覆盖下的土壤，利用Illumina MiSeq高通量测序技术，对土壤细菌进行菌落结构分析以及功能性预测，研究土壤细菌的组成和多样性，并将之与相邻未堆放垃圾处的土壤微生物群落组成和功能进行比较，以期阐明生活垃圾覆盖对土壤细菌群落结构的影响，为生活垃圾的合理处置和垃圾污染土壤的修复提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 采样地概况 采样地点位于安徽省合肥市方兴社区，合肥市滨湖新区的核心区域，辖区面积11.8km2，规划人口30萬。区域属于亚热带季风气候，年均气温15.7℃，年降水量约为1000mm，年日照时数约2000h，年平均无霜期228d，平均相对湿度77%;供试土壤类型为黄棕壤。

1.2 样品采集 在方兴社区生活垃圾堆放密集位置，按照5点采样法选择5个10cm×10cm规格的样方，除去土壤表面杂草、枯叶和表层土，取距离表层约20cm处的土块，将5个土样混合均匀取1kg装入无菌自封袋，作为处理组（T）;同时在垃圾堆周围5m处，随机采集5点未堆放垃圾的0～20cm处土壤混合留存1kg装入无菌自封袋，作为对照组（C）。2组土壤放入低温保温箱带回实验室后立即进行除杂和过筛处理，然后置于-80℃冰箱中备用。

1.3 土壤总DNA的提取和高通量测序、分析 按照Fast DNA? Spin Kit for Soil（MP Biomedicals，U.S.A）试剂盒提供的方法提取土壤总DNA。土壤基因组DNA经凝胶电泳和NanoDrop2000测试质量合格后，利用引物序列515F（5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）、806R（5- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）对16S rRNA的V4区进行PCR扩增，退火温度为47℃[8]。将PCR扩增得到了DNA产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，取1μL体积的DNA产物于电泳槽内加入相应的marker进行对照，发现PCR产物的长度为300bp左右的DNA条带，选择此条带进行上机测序。送至上海美吉生物医药科技有限责任公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.4 数据处理与统计 测序数据采用双端数据fastq保存，使用Trimmomatic软件质控，截去Barcode和引物序列后使用FLASH软件进行拼接、过滤、去除嵌合体序列[9]，得到有效数据;使用UPARSE软件（v7.0.1090）根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，根据OTU列表中的各样品物种丰度情况，应用软件Mothur（v.1.30.2），计算种群丰富度指数Chao和ACE和群落多样性指数 Shannon 和 Simpson;采用RDP classifier贝叶斯算法[10]对OTU代表序列进行分类学分析将优化序列根据silva库中的参考序列对OTU进行种属鉴定[11]。利用R软件在门（phylum）和属（genus）的水平上作样品群落分布柱状图。使用PICRUSt（v2.0.0）软件进行基因功能预测，根据功能分类丰度，绘制功能丰度热图。

2 结果与分析

2.1 测序结果 对无生活垃圾覆盖（C）和有生活垃圾覆盖（T）处理的土壤细菌16S rRNA基因序列的V4可变区进行高通量测序，分别得到71759和75052条序列，在剔除引物、低质量序列后，分别得到55935和47812条有效序列。对有效序列基于97%的序列相似度进行归并和OTU划分，处理组和对照组一共得到1153个有效的OTU，分别为831和1102个;在门水平得到33个分类单元，2个处理分别为24和32个;在属水平得到373个分类单元，2个处理分别为299和351个。

2.2 土壤细菌多样性 2个处理的土壤细菌Alpha多样性结果见表1。由表1可知，处理组的Chao1和ACE指数均比对照组低24.06%和20.72%，无生活垃圾覆盖的土壤细菌具有更高的丰富度;处理组的shannon指数低于对照组17.84%，而simpson指数高于对照组，没有生活垃圾覆盖的土壤物种多样性更高。2组样本的测序覆盖率均在 99%以上，说明取样合理，测序数据能够真实反映土壤样品中的微生物群落。

2.3 土壤细菌组成 土壤细菌群落组成分析结果表明：在门水平，处理组与对照组的土壤细菌组成非常相似，相对丰度均以厚壁菌门（Firmicutes）为最高，在2处理中分别为68.42%和24.73%，其次依次为变形菌门（Proteobacteria）（9.84%、16.20%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（2.85%、11.43%）、酸杆菌门（Acidobacteria）（7.09%、6.81%）、放线菌门（Actinobacteria）（4.80%、6.95%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）（0.81%、9.30%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（1.54%、2.69%）、浮霉菌门（Planctomycetes）（0.84%、2.35%）、匿杆菌门（Latescibacteria）（0.25%、1.88%）和GAL 15（0.04%、4.69%）（图1）。相较于对照组，处理组中厚壁菌门和酸杆菌门的相对丰度增加，其中厚壁菌门增加幅度最大，为43.68%;而变形菌门、绿弯菌门、放线菌门、芽单胞菌门等相对丰度减少，其中绿弯菌门减少幅度最大，为8.58%。

在属水平上，2组处理均以芽孢杆菌属（Bacillus）的相对丰度最高，分别为37.05%和10.50%（图2）。相较于对照组，处理组中芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、膨胀芽孢杆菌属（Tumebacillus）、未分类的动球菌科的相对丰度增加，分别增加26.56%、1.74%、1.43%、3.34%;Rokubacteriales、厌氧绳菌科、虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus）、MND1、Ramlibacter、溶杆菌属（Lysobacter）的相对丰度减少，分别减少3.53%、1.91%、1.50%、3.38%、1.60%和1.15%。

通过Venn图分析2个处理土壤细菌共有的属数量及特有的属数量，共有的属数量有277个，对照组特有的属数量有74个，处理组特有的属数量有22个（图3）。其中芽单胞菌属（Gemmatimonas）、铁氧化属（Sideroxydans）、Desulfosporosinus为对照组特有的菌属。尿素芽孢杆菌属（Ureibacillus）、Planktosalinus、漠河杆菌属（Moheibacter）、Ferruginibacter等为处理组特有的菌属。

2.4 土壤的细菌功能性预测 通过对KEGG数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）進行比对预测结果，发现在KEGG一级功能层中有6个代谢通路：细胞过程（Cellular processes）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、人类疾病（Human Diseases）、代谢（Metabolism）、有机体系统（Organismal Systems），其中代谢功能的占比最高，处理组中达到了68.21%，对照组为68.36%。在基因二级功能预测分析中发现由碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）、能量代谢（Energy metabolism）、辅助因子和维生素的代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、全局和概览地图（Global and overview maps）、膜运输（Membrane transport）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、信号传导（Signal transduction）、类脂化合物代谢（Lipid metabolism）等46个子功能组成（图4）。相较于对照组，处理组中的碳水化合物代谢、膜运输、信号传导、耐药性等功能增强，相对丰度分别升高1.11%、0.9%、0.4%、0.07%;氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、其他次生代谢物的生物合成、多糖的生物合成和代谢等功能有所降低，相对丰度分别降低0.19%、0.15%、0.31%、0.25%、0.25%。基因三级功能预测分析发现有15条碳水化合物代谢途径，包括丙酮酸代谢、糖酵解、氨基酸和核苷酸代谢、乙醛酸代谢、淀粉和蔗糖的代谢、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径等。相对于对照组，处理组中淀粉和蔗糖的代谢增加幅度最大，为0.28%。

3 结论与讨论

3.1 结论

3.1.1 垃圾堆放对土壤细菌多样性的影响 通过对有无垃圾堆放的土壤细菌群落进行Misep高通量测序，发现无生活垃圾堆放的土壤细菌群落丰富度和多样性均高于有生活垃圾堆放的。这与贺晓凌[12]研究垃圾填埋场近端的土壤微生物多样性大于远端的结果不同;王晓琳[13]研究得出在不同填埋深度的土壤中，微生物多样性随深度增加而减少。这些相反的研究结果表明微生物的多样性受多方面因素共同影响，如生活垃圾种类、堆放时间[14]、堆放地理位置[15]、土壤深度[5，13]等，与垃圾堆放的扰动并不是线性相关。垃圾堆放过程中会产生含有有机化合物、病菌、寄生虫以及有毒有害物质和重金属的高浓度有机废水垃圾渗滤液，可通过地表径流下渗至土壤中，本研究区域可能受垃圾污染严重，土壤微生物活性受到抑制，导致多样性和丰富度下降。

3.1.2 垃圾堆放对土壤细菌组成的影响 研究结果表明，2个处理土壤细菌种类在门水平上十分相似，但相对丰度有所不同。处理组中，优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria），这与吴双等[16]、黄耀民等[17]研究结果一致。相较于对照组，厚壁菌门的增加幅度最大，绿弯菌门的减少幅度最大。厚壁菌门大都可以产芽孢，可以抵抗极端环境，因此能在被垃圾污染的环境中大量生存[18]。有报道称，厚壁菌门（Firmicutes）的丰度与土壤中铅、锌、镉和铜的含量呈显著正相关[19]，而处理组厚壁菌门的相对丰度高于对照组43.68%，可以间接说明垃圾堆放导致土壤中重金属含量增加，这与夏立江等[20]研究北京西郊垃圾堆放场中垃圾区的重金属含量高于对照组的结果一致。绿弯菌门在旱地土壤中占绝对优势，而生活垃圾中厨余垃圾的含水率高，垃圾堆放会增加土壤的含水量，对绿弯菌门的丰度造成负面影响[21]。

土壤細菌类群比较复杂，在属水平上，处理组有62%的未分类菌属，对照组有78%的未分类菌属，未知属的价值有待于进一步研究。相较于对照组，处理组中芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、膨胀芽孢杆菌属（Tumebacillus）、未分类的动球菌科的相对丰度增加;Rokubacteriales、厌氧绳菌科、虚构芽孢杆菌属（Fictibacillus）、MND1、Ramlibacter、溶杆菌属（Lysobacter）的相对丰度减少。其中芽孢杆菌属相较于对照组增加幅度最大，为26.56%。芽孢杆菌为环境样品中的常见细菌，不仅具有较强的降解纤维素能力，而且还能降解芳香族化合物和重金属络合物，多生活在碱性、适盐、高温的环境下，通常为与垃圾填埋场环境较为相似的农业废弃物中的优势种群。垃圾覆盖条件下土壤有益菌的相对丰度减少，其中溶杆菌属对线虫和植物病害具有生防作用[22];虚构芽孢杆菌属偏好碱性[23]，具有除磷[24]、抗虫[25]、重金属砷耐受性[25]等生物学活性，这些菌属为土壤修复提供了宝贵的微生物资源。

3.1.3 垃圾堆放对土壤细菌功能的影响 目前，针对垃圾堆放对土壤细菌功能的研究开展较少，本研究将MiSeq高通量测序结果进行PICRUSt功能预测分析。结果显示，在level 1水平上不同处理均以代谢为主要功能，2组样品预测功能基因多样性保持一致，但相对丰度略有差别，其中处理组的代谢功能高于对照组。在level 2水平上代谢通路主要是碳水化合物代谢途径，处理组高于对照组1.1%，可能是因为合肥市垃圾的主要成分为有机质，所占比例达60%[26]，而有机质含量高可以增强土壤微生物对各类碳源的代谢能力[27]。其中处理组中的优势菌门酸杆菌门作为嗜酸菌具有降解植物残体多聚体、增强光合作用及参与单碳化合物代谢等功能[28]。在处理组的特有菌属中，尿素芽孢杆菌属可以利用各种有机物（单糖、双糖、淀粉、有机酸等）作为碳源和能源[29]。在level 3水平上碳水化合物的代谢主要是通过丙酮酸代谢、糖酵解、氨基酸和核苷酸代谢、乙醛酸代谢、淀粉和蔗糖的代谢、柠檬酸循环、磷酸戊糖途径等途径。相较于对照组，处理组淀粉和蔗糖的代谢增加幅度最大。基于PICRUST只能对已知微生物的已知功能进行功能预测的局限性，后期可以与宏基因组研究相结合，以更加深入地探讨微生物的功能。

3.2 讨论 生活垃圾堆放会显著降低土壤细菌的多样性，改变土壤细菌的群落组成，但不会改变土壤细菌群落的核心功能;不论是否堆放垃圾，土壤细菌的主要功能均为代谢，且都是碳水化合物代谢。由此可见，为降低垃圾堆放对土壤微生物及土壤质量的影响，应加强对垃圾的分类收集及资源化利用。本研究取样数量偏少，且缺少对土壤理化特性的分析，难以探究群落组成差异形成的机制，因此今后需增加该部分的研究，以全面系统地评价生活垃圾堆放对土壤细菌群落结构和功能的影响。

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（责编：徐世红）